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遗传与育种学实验

遗传与育种学实验. 宁波大学生命科学与生物工程学院. 实验目录. 实验一：减数分裂的观察 实验二：核型分析 实验三：同工酶技术 实验四：遗传平衡定律. 实验一：减数分裂的观察. 实验目的： 掌握减数分裂制片方法和技术； 观察并熟悉减数分裂各期染色体的特征。 材料： 蝗虫精巢 步骤：

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遗传与育种学实验

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  1. 遗传与育种学实验 宁波大学生命科学与生物工程学院

  2. 实验目录 • 实验一：减数分裂的观察 • 实验二：核型分析 • 实验三：同工酶技术 • 实验四：遗传平衡定律

  3. 实验一：减数分裂的观察 • 实验目的：掌握减数分裂制片方法和技术； 观察并熟悉减数分裂各期染色体的特征。 • 材料：蝗虫精巢 • 步骤： 捕捉雄性蝗虫，解剖取出精巢，Carnoy固定液（无水乙醇: 冰醋酸=3:1）固定三小时，70%酒精保存。实验时先在一张干净的载玻片上滴1滴醋酸洋红，然后取一根精细管，放在醋酸洋红染液中染色5－10分钟，盖上盖玻片后压片（指压法，笔头敲击）观察。 注意压片时要小心，避免压破玻片，并尽量使材料散开，以免细胞重叠影响观察。

  4. 减数分裂各期特征： 前期I： 1、细线期特点：染色质凝集，染色体呈细长单条线状，盘绕成团，此时染色体已经过复制，但看不出是成双的。 2、偶线期特点：各对同源染色体配对（联会），结果细胞中的染色体由2n单价体变成了n条二价体。

  5. 1、细线期和2、偶线期

  6. 3、粗线期特点：又称重组期，开始于同源染色体配对完成后，n个染色体（配对的染色体称二价体）进一步变短变粗，SC（联会复合体）仍然存在，同源染色体的非姊妹染色体间可以发生局部交叉和交换，核仁大。

  7. 3、粗线期

  8. 4、双线期特点：又称合成期，可见四分体。染色体进一步缩短，组成二价体的两条同源染色体表现相斥而分离，但由于同源染色体之间的交换尚未完成，因而在不同的二价体上，在不同的部位，不同程度出现交叉现象，使二价体成为“X、V、8、0”等形状。

  9. 4、双线期

  10. 5、终变期特点：又称再凝集期。四分体较均匀地分布在核中，交叉向染色体臂的端部移行，称为端化。染色体凝集成短棒状。

  11. 5、终变期

  12. 中期I：纺锤体形成，排在赤道板上的二价体开始分离，交叉端移。中期I：纺锤体形成，排在赤道板上的二价体开始分离，交叉端移。

  13. 后期I：二价体中的同源染色体分开，真正减数。末期I：后期I：二价体中的同源染色体分开，真正减数。末期I：

  14. 前期II：中期II：具有两个染色单体的染色体 排在赤道板上。

  15. 后期II： 着丝粒纵裂，姐妹染色单体分开。

  16. 末期：染色体解旋，核膜重建等。

  17. 实验报告 • 根据你所观察的结果绘制蝗虫精巢减数分裂过程中的染色体图像

  18. 实验二：核型分析 • 实验目的： 掌握骨髓细胞染色体标本的制备技术； 了解和掌握染色体核型分析的方法。 • 实验原理： 秋水仙素是一种生物碱，它能抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不走向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞就不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。若染色体加倍的细胞继续分裂，就能形成多倍性的组织。通过一定的方法，将染色体制成片子，就能在显微镜下观察和鉴定染色体的数目。

  19. 实验步骤： • 牛蛙按30微克/克体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，15－16h（如果不诱导多倍体只需7－8h）后以解剖针破坏牛蛙脑脊髓的方式处死牛蛙。 • 迅速解剖牛蛙取后肢的胫骨和股骨，剔除附着的肌肉，然后剪掉骨头两端。 • 用注射器将约1ml 1％ 柠檬酸钠注入骨髓腔，将骨髓细胞连同组织冲入离心管，用注射器反复抽打骨髓，使细胞团块分散。 • 2000 r/min离心5 min。

  20. 实验步骤 • 向离心管内加入0.075M KCl，使总量为10ml左右，室温（或37 ℃ ）静置低渗处理40min。 • 2000 r/min离心5 min。 • 弃上清液，沿管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液约5 ml，加完后用吸管将细胞团轻轻吸打均匀，静置固定20 min。 • 2000 r/min离心5 min。 • 再加固定液固定20 min 。

  21. 实验步骤 • 离心弃上清液后，加入约1.5 ml新固定液，将细胞团吸打成细胞悬液。 • 在干净、预冷的载玻片上滴2－3滴细胞悬液，干燥。 • 用1：10（Giemsa原液：磷酸缓冲液）染色液覆盖细胞染色8~15 min。 • 细流洗掉染色液，干燥后镜检。

  22. 实验报告 • 根据牛蛙染色体照片进行核型分析

  23. 核型分析方法 • 对放大的牛蛙染色体照片进行相关参数的测量 • 臂率＝长臂/短臂 • 着丝粒指数＝（短臂/该染色体长度）×100 • 相对长度＝(每条染色体长度/总长度)×100 • 总长度＝该细胞单倍体全部染色体长度之和

  24. 核型分析方法 • 分类 根据臂率值确定染色体着丝粒位置，进而依照着丝粒的位置将染色体分为四类：

  25. 核型分析方法 • 配对 根据测量数据，比较染色体的形状、大小、相对长度、臂比、着丝粒指数、随体的有无等特征，对照片上的染色体进行粗剪和同源染色体配对。 • 排列。 • 将配对的染色体按由大到小的顺序粘贴排列在实验报告纸上，对于等长的染色体，短臂长的排在前面。 • 排列时短臂在上，长臂在下。 • 着丝粒排在同一条直线上。

  26. 实验目的： 实验三：同工酶技术 • 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 • 理解同工酶的概念及遗传学意义

  27. 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂又称为共聚体的Ｎ，Ｎ－甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis（PAGE）。 聚丙烯酰胺凝胶的优点： 1）化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感； 2）重复性好； 3）灵敏度高，可达10-6 g； 4）分辨率高。

  28. 原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中上层浓缩胶和下层分离胶由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动有： (1)电荷效应； (2)分子筛效； (3)还具有浓缩效应:较厚的蛋白质加样层可以被浓缩成很薄的蛋白质层。 因而分离条带清晰度及分辨率佳。

  29. 同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。 它们是由遗传体系决定的即相同的基因在不同组织中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同.由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的差异，在电泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。 生物体内存在多种同工酶,其中最经典的是乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase)简称LDH。

  30. 试剂： （１）凝胶缓冲液：称取１mol／L HCl 48 mL，Tris（三羟基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）0.23mL，加重蒸水至80mL使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸水定容至100mL，置棕色瓶，4℃贮存。 （2）分离胶贮液：30%Acr-0.8%Bis贮液：丙烯酰胺（Acr）30.0g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水使其溶解后定容至100mL。 （3）分析纯过硫酸胺（AP）（AR）0.14g加重蒸水至100mL，置棕色瓶，4℃贮存仅能用一周，最好当天配置。 以上三种试剂用于制备分离胶。 （4）浓缩胶缓冲液：称取1mol/L HCl 48mL，Tris 5.98g，TEMED 0.46mL，加重蒸水至80mL，调pH6.7，用重蒸水定容至100mL，置棕色瓶，4℃贮存。 （5）浓缩胶贮液：称Acr 10g，Bis 2.5g，加重蒸水溶解后定容至100mL，过滤后置棕色瓶，4℃贮存。 （6）40%蔗糖溶液（W/V）。 以上（3）-（6）四种溶液用于配制浓缩胶。

  31. 器材： 夹心式垂直板电泳槽，凝胶膜，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），吸管，烧杯（25，50，100mL），细长头的滴管，微量注射器，培养皿 图 夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统

  32. 操作方法： 1.安装电泳槽 2.贮液制备 3.制备凝胶板 （1）分离胶制备： 分离胶缓冲液pH8.9Tris-HCl（TEMED）2.50mL；凝胶贮液30%Acr-0.8%Bis 5.00mL；重蒸水2.50mL ；0.14%AP 10mL 　 混匀后的凝胶溶液倒入玻璃板之间的窄缝内，加胶高度距上端口2cm为止。用注射器在凝胶表面轻轻加上一层重蒸水，用于隔绝空气，使胶面平整。约30min-60min后凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面的界线。倒去上层的重蒸水。 （2）浓缩胶的制备：浓缩胶为pH6.7 2.5%PAA，其配制方法如下： 浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl（TEMED）1mL；浓缩胶贮液10%Acr-2.5%Bis 2mL；40%蔗糖 4mL；0.14%AP 3mL 混合均匀后加到分离胶上方，距短玻璃板上缘0.5cm处。轻轻插入样品槽模板。约2-3小时后凝胶完全聚合，轻轻取出样品槽模板，用滤纸吸去多余的液体，加入稀释10倍的pH8.3的电极缓冲液，使液面没过短玻璃板0.5cm，即可加样。

  33. 4.样品制备： • 取材：鲫鱼若干条，解剖取1.肠、2.眼睛、3.卵、4.肉、　　　5.胆、6.胰、7.鳃、8.肝、9.心脏　放入冰箱保存。 • 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液tris-Hcl(pH=7.0)　　此溶液需４℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为１：５。用玻璃匀浆机冰浴中匀浆。匀浆液４℃离心约３０分钟，１５０００转／分钟。 • 取上清液用１５０ul离心管分装，加１００ul 甘油和１０　　ul溴芬蓝混匀即可点样。 5.加样： 作为分析用的PAGE加样量仅需几微克。用微量注射器取20 -30μL样品，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。我们今天采用的原料是鲫鱼，有9种不同的样品（1.肠、2.眼睛、3.卵、4.肉、5.胆、6.胰、7.鳃、8.肝、9.心脏），各组每个同学记下样品顺序，待所有样品槽都加了样品，即可开始电泳。

  34. 6.电泳：将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框上缘1cm时，将电流调回到零，关电源取出电泳板，轻轻将一块玻璃板移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。6.电泳：将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框上缘1cm时，将电流调回到零，关电源取出电泳板，轻轻将一块玻璃板移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 7.染色：将配好的同工酶染色贮存液倒入培养皿中，染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min左右。 ＊染色液配制 NAD+（氧化型辅酶） PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1M乳酸钠液（Ph7.0） 0.1M氯化钠 0.5MTris-盐酸缓冲液（pH7.1） NBT（氯代硝基四氮唑蓝) 临用前配置，所需体积已标在棕色瓶上？。

  35. 参考染色方法： 1、电泳结束后,取出胶条用蒸馏水漂洗后浸入染色液中置37℃温箱中保温染色 60min.染色液配方:NAD25mg,NBT60mg,PMS7.5mg,20%乳酸钠磷酸缓冲液(pH7.5)10ml, 蒸馏水30ml. 2、乳酸脱氢酶的辅酶是NAD+。当乳酸脱氢酶催化乳酸脱氢时，NAD+即被还原为NADH。当有吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）存在时，则发生如下反应： NADH+H++PMS------ NAD++ PMS·H2 PMS·H2+NBT------PMS+ NBT·H2 NBT·H2为蓝紫色化合物。 基本染色液：称取NBT30mg，50mgNAD+，2mgPMS，15ml 0.5M pH7.5 PBS，1M 乳酸钠溶液10ml，5ml 0.1M NaCl，定容到100ml。 3、按下列比例配置反应染色液 0.2%NBT:0.2%PMS:0.01mol/l NAD:70～80%乳酸钠:0.05mol/l磷酸钠缓冲液PH7.0＝8:1:5:10:26。在37℃黑暗条件下保温20～30分钟，酶带被染成蓝色。 4、用NAD 66mg，NBT 35mg，PMS 2mg，1mol/l乳酸钠溶液10ml，0.1mol/l Tris-HCl PH7.0缓冲液50ml，蒸馏水40ml。在37℃黑暗条件下保温2小时，酶带被染成蓝色。

  36. 8.拍照 9.结果处理 各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm) 思考题： • 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？ • 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝的40%蔗糖溶液？蔗糖和溴酚蓝有何用途？ • 从遗传学角度思考为什么同一基因在不同组织会出现同工酶？

  37. 1、实验目的： 实验四：遗传平衡定律 • 进一步理解Hardy-Weinberg定律 • 调查周围人群中ABO血型系统的基因频率和基因型频率的情况

  38. 2、实验原理： 在一个大的随机交配的群体中，在无突变、无任何形式的选择、无迁入迁出、无遗传漂变的情况下，群体中的基因频率和基因型频率可以世代相传不发生变化，而且基因型频率是由基因频率决定的。

  39. 3、实验方法和步骤： 对周围人群的ABO血型的不同表现型进行统计，进而估算出基因频率。 表 不同血型的表现型人数统计

  40. 设p = IA的频率， q = IB的频率， r = i的频率 当群体处于平衡状态时，p + q + r = 1 P2 + q2 + r2 + 2pq + 2pr + 2qr = 1 又设A，B，AB，O为各血型的表现型频率 则： A = P2 + 2pr B = q2 + 2qr AB = 2pq O = r2 根据遗传平衡公式计算出各基因频率，并检验此群体是否处于平衡状态。

  41. 4、思考题： 实验中的数据是否满足遗传平衡公式？为什么？

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