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NDM-1 基因的检测与确认

ICDC, China CDC. NDM-1 基因的检测与确认. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所. NDM-1 简介. 一个新发现的耐药基因，全长 826bp 编码 1 型新德里金属 β- 内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药 位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒 pKpANDM-1 上 Genbank FN396876 （ 2009.11.24 ） 具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性：？？

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NDM-1 基因的检测与确认

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Presentation Transcript

  1. ICDC, China CDC NDM-1基因的检测与确认 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

  2. NDM-1简介 • 一个新发现的耐药基因，全长826bp • 编码1型新德里金属β-内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药 • 位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒pKpANDM-1上 Genbank FN396876 （2009.11.24） • 具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性：？？ E.coli Genbank AB571289 （2010.07.10）

  3. NDM-1的基因检测 • PCR检测 • 序列测定——最终确认 • 检测对象： • 已经过表型筛检的菌株进行NDM-1基因确认 • 对大批菌株直接进行筛检 • 对标本的检测 • 高通量、快速、准确

  4. PCR检测方法——模板制备 • 模板制备：菌株、标本 • 菌株 （1）G-细菌： a. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200μl纯水 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 ℃保存 b. 试剂盒提取基因组DNA（说明书）

  5. PCR检测方法——模板制备 • 菌株 （2）G+细菌： a. 试剂盒提取基因组DNA（说明书） 溶菌酶充分作用 b. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200 μ l纯水 低温反复冻融（-40 ℃以下或液氮） 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 ℃保存 2. 标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒

  6. PCR检测——引物选择 • 引物选择： • 扩增片段位于CDS正向的191-482位置（反向345-636位置） 483-769位置（反向58-344位置） • 引物特异性较好，理论上无非特异扩增片段

  7. PCR检测——PCR体系 • 引物合成稀释 • 冻干粉末，开启前10000rpm离心5min • 小心开盖，防止粉末喷出 • 1.0OD+268 μ l纯水，充分震荡混匀 ，浓度20 μ M（20 μ mol/L） • 20 μ l体系（右图） • 若使用含有Mg2+的10×buffer的加入量同上表，MgCl2体积用水补齐 • PCR Premix预混液（根据说明书）

  8. PCR检测——PCR体系 • 没有阳性对照，如何确保体系正常运转 • 同批 配置体系时：增加1管不使用NDM-1引物 加入常用引物及模板，扩增其他已知片段 • 人工合成长片段DNA作为阳性对照？？ 不建议合成：首次发现时如何排除“污染”质疑 如果一定要合成：在中间区域加入若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志

  9. PCR检测——PCR反应条件与电泳 • 反应条件：（约耗时1小时25分钟） 94℃ 5min 94℃ 15sec Tm℃ 30sec 25个循环 72℃ 30sec 72℃ 5min • 电泳：1.5%琼脂糖电泳 marker：DL2000

  10. 基因序列测定——最终确认 • PCR阳性结果：携带NDM-1基因 非特异扩增 • 最终确认：序列测定 • 测序公司，当天得到结果 • 测序样品：100 μ l以上PCR产物 • 引物及其浓度：上下游引物各10 μ l（20uM） • 测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列

  11. 基因序列测定——测序结果判读 • 测序彩图：峰体清晰、无套峰

  12. 基因序列测定——测序结果判读 • 起始段结果（10-30bp）、反应结果段结果（>500bp）不可用 • 双向测序结果拼接

  13. 基因序列测定——序列比对 • 下载参考序列： Genbank：FN396876.1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/255031061 AB571289、HQ171206、HM853678 • 将测度序列与参考序列比对： 常用软件：Clustal、DNAstar、Mega…… • 最终确认是否为NDM-1基因序列 • 判定该细菌携带NDM-1基因

  14. NDM-1基因携带与耐药 • 抗生素敏感性——细菌表型特征 耐药基因正确表达，表现出细菌的抗生素敏感性 一种细菌可具有多种耐药机制 NDM-1只是其中一种 该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果 • NDM-1基因的检测与确认——基于基因水平的判断 菌株A携带NDM-1基因 • 菌株A的耐药谱，NDM-1基因对于这株菌的作用 ——具体问题具体分析

  15. 谢谢大家！！

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