1 / 13

A DNS Szekvenálás

A DNS Szekvenálás. 2008 Géntechnikák labor. Bevezetés. Restrikciós enzimek / restrikciós térképek Genom könyvtárak Fehérje aminosavsorrend meghatározás Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok) Direkt szekvenálás Egyféle termék Klónozott PCR termék

cloris
Download Presentation

A DNS Szekvenálás

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor

  2. Bevezetés • Restrikciós enzimek / restrikciós térképek • Genom könyvtárak • Fehérje aminosavsorrend meghatározás • Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok) • Direkt szekvenálás • Egyféle termék • Klónozott PCR termék • Többféle termék • Egymásra rakódó szekvenciák • Klónozás plazmidba

  3. Módszerek • Maxam-Gilbert-féle kémiai degradáció • 5’ radioaktív izotópos jelölés (32P) • Bázis specifikus hasító reakciók • Elektroforézis, autoradiogramm • Mérgező anyagok, négy reakció • Sanger-féle enzimatikus módszer • Automatizálható!!!!! • Az eljárás közben nő a DNS mennyisége, tehát kisebb mennyiségű is kimutatható • Egy reakcióban is megoldható • Fluoreszcens molekulával jelölt primer, vagy didezoxinukleotidok • PCR + Elektroforézis poliakrilamid gélben

  4. Areakcióelegy: • Templát • Oligonukleotid primer • DNS polimeráz • Dezoxinukleotidok (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) • Didezoxinukleotidok (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)

  5. A szekvenálás • Denaturáció • Anelláció • Egy primer • Elongáció • Véletlenszerű lánc termináció

  6. A szekvenálás menete

  7. Elválasztás • Elektroforézis kapillárisban (375μm / 75μm) • Nagy felület-térfogat arány → nagy hőleadóképesség → nagyobb feszültségnél sem melegszik annyira • Kis feszültség: szebb elválasztás • Poliakrilamid mátrix • Betöltés: nagynyomású nitrogén • nagy felbontás • Minta bejuttatása • Elektrokinetikus injektálás • Megfelelő neg. Ionok (DNS) legyenek csak! • Ha eltömődik a kapilláris, leesik az áramerősség

  8. Detektálás • A jelölő molekulát lézerrel gerjesztjük, majd mérjük a fluoreszcenciát • Fluoreszcensen jelölt primer • Négy reakció • Mindegyikben csak egy didezoxinukleotid • Négy futtatás • Fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidok • Egy reakció • Egy futtatás • Minden ddNTP más hullámhosszon detektálható

  9. Kiértékelés • A jelekből egy szoftver kromatogrammot készít, a bázisokat eltérő színű csúcsok jelölik. • Szekvencia ellenőrzés!!!!! • Olvashatatlannak ítélt pozíciók N betűi • Kiértékelési hibák • Kimaradt betűk

  10. Szekvenciák összehasonlítása • Fontos mindkét szálat megszekvenálni, és összehasonlítani az eredményeket. • Összehasonlításhoz ingyenes internetes szoftverek. (Clustal, Multalin)

  11. TTV típusok genomjának összehasonlítása (Multalin)

  12. Irodalomjegyzék • Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia • Multalin ( http://ribosome.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html )

  13. Köszönöm a figyelmet!

More Related