1 / 7

GST-FYVE oprensning

GST-FYVE oprensning. Kasper Kistrup, Niels Højsgaard og Mads Topp Nano-Science Center. Oprensning af GST-FYVE. Indsætning af gen i plasmid vektor  Indsæt vektor i værtscelle ( Transfektion )  Lad populationen gro (inkubering v. 37 º C)  Udtrykning af vores gen (Inducering v. IPTG)

clarke
Download Presentation

GST-FYVE oprensning

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 14. September GST-FYVE oprensning Kasper Kistrup, Niels Højsgaard og Mads Topp Nano-Science Center

  2. 14. September Oprensning af GST-FYVE • Indsætning af gen i plasmid vektor •  • Indsæt vektor i værtscelle (Transfektion) •  • Lad populationen gro (inkubering v. 37ºC) •  • Udtrykning af vores gen (Inducering v. IPTG) •  • Selektion •  • Høst af celler / Sonikering •  • Affinitets kromatografi

  3. 14. September DNA Kloning

  4. 14. September Høst og oprensning • Centrifugering og dekantering af supernatant • Pellet af E.coli tilbage • Sonikering • Cellelysis • Centrifugering • Store celledele (Lysozyme, membraner etc) bundfældes (Gem prøve, P4) • Supernatant filtreres i et Millipore filter (Store proteiner etc) (Gem prøve, P3)

  5. 14. September Affinitets kromatografi • Protein prøve i søjle • Eluering af uønskede proteiner (Gem prøve, P5) • Vask med PBS for at fjerne uønskede proteiner (Gem prøve, P6) • 10x1mL eluerings fraktioner • Fraktion 2 og 3 udtages (P8 og P9) • Regenerer søjlen

  6. 14. September Indhold af SDS-brønde • LMW (Markør) • P1 – E.coli • P2 – E.coli efter 4 timers inkubation • P3 – Supernatant efter sonikering og centrifugering (Spild) • P4 – Bundfald efter sonikering og centrifugering • P5 - Eluering af uønskede proteiner • P6 - Vask med PBS for at fjerne uønskede ting • P8 – Eluent 2 fra søjlen • P9 – Eluent 3 fra søjlen

  7. 14. September Resultater • GST-FYVE ved ~40-42 kDa markøren (Fra SDS-gel) • Fra MALDI-TOF: GST-FYVE vejer 41 kDa

More Related