结核病实验室诊断技术及其进展

1. 结核病实验室诊断技术及其进展 中国疾病预防控制中心结核病防治临床中心 国家结核病参比实验室 赵雁林 2006年5月

2. 内 容 • 结核病的诊断 • 实验室诊断需要关注的问题 • WHO推荐的肺结核的诊断标准 • 肺结核的实验室诊断 • 结核病的实验室诊断新技术

3. 生物医学研究模式发生变化趋势 1. 结构基因组学向功能基因组学转变 2. 基因组学向蛋白组学转变 3. 以作图为基础的基因鉴定向以序列为基础的基因鉴定转变 4. 单基因病研究向多基因病研究转变

4. 生物医学研究模式发生变化趋势（续） 5. 对疾病的特异性DNA诊断向疾病易感性鉴定转变 6. 分析单个基因作用向研究基因作用的调控机制转变 7. 研究疾病的病因向研究疾病的病理发生机制转变 8. 研究单一种属向研究多种种属转变。

8. M. tuberculosis H37Rv • 441 .1万碱基对 • 3924 预测基因（3995 predicted protein-coding genes) • 65.6 % GC 含量 Cole ST et al. Nature 1998; 393: 537.

9. 重复DNA Repetitive DNA in the Mycobacterium tuberculosis Complex 分类： 1.串联重复序列 Tandem Repeats(TRs） 卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA VNTR 2. 散在重复序列 Interpersed Repeats

10. GC富含重复序列和主要的串联重复序列 Polymorphic GC-Rich Repetitive Sequence & Major Polymorphic Tandem Repeats PGRS & MPTS PE\PPE

11. Mycobacterial Interspersed Repetitive Units MIRUs根据长度、序列组成分为三个subfamilies,在H37Rv中大小在46到101bp, 有65个拷贝的MIRU在41个loci中出现。 MIRU与其它已知重复序列的不同点： 结构特点（无明显的回文结构） 插入位点 编码能力 具有散在重复序列和VNTR序列的双重特点

12. 散在重复序列 范围： 基因复制 短的序列重复 移动的遗传元件 IS Elements REP13E12 Family Prophage CRISPR Sequences(spoligotyping) clustered regularly interspaced short palindromic repeats

13. 实验室检查 实验室检查的目的是为了疾病的诊断，要求检测出标本中某物质的真实含量和反应。 真实物理含量，即所谓“真值” 由于人类 认识能力的局限性， 使得误差不能完全避免。 误差分类： 过失误差 方法误差（系统误差、随机误差） 抽样误差 生物误差

14. 肺结核的诊断 • 结核病人因症就诊是病人发现的主要方式 • 涂片显微镜检查对于传染性、预后和治疗评价有一定作用。 • X-线对于结核病的诊断不是一种特异性的方法 • 核酸扩增试验和血清学方法对于结核病的诊断有一定的价值（有待进一步研究）

15. 非结核分枝杆菌 • Ⅰ 缓慢生长 光产色 堪萨斯、海、猿分枝杆菌 • Ⅱ 缓慢生长 暗产色 瘰疬、苏加 • Ⅲ缓慢生长 不产色 鸟胞内 蟾分枝杆菌 • Ⅳ快速生长 偶发、龟 • 非结核分枝杆菌不能使豚鼠致病 • 1886年Lenman和Neaman命名 • 结核分枝杆菌

16. 生物标本 生物样本成分千差万别 合格的标本 如果每毫升灌洗液中超过105 个集落形成单位，某一微生物存在，且有该微生物感染的其他临床表现，则该微生物可能就是病原菌 流感病毒和呼吸道合胞体病毒正常情况下不存在于呼吸道。

17. 结核免疫 • 经典免疫学认为，结核的免疫属于传染免疫（infection immunity),又称有菌免疫，即只有当结核菌在体内存在时才有免疫力，一旦体内的细菌被杀灭，免疫力随即消失。机体对结核分枝杆菌能产生抗体，但无免疫保护作用。 • TB accelerates the progression of HIV disease

18. 咳嗽、咯痰大于等于 3周 If 1 positive, X-ray and evaluation AFB X 3 If 2/3 positive: Anti-TB Rx 阴性 广谱抗生素治疗10-14天 如果症状没有改善, 重复 AFB, X-线 诊断 TB 抗结核治疗 结核病的诊断

19. 显微镜涂片检查较 X-线检查更 客观、可信 专家组一直同意诊断

20. 显微镜涂片检查的特异性 较 X-线检查好 特异性

21. X-线诊断结核病的过诊问题 过诊 NTI, Ind J Tuberc, 1974

22. HIV Negative 70 60 Early HIV 50 40 Late HIV 30 20 10 0 HIV/AIDS中涂阳肺结核病人的比例 AFB positivity in TB patients

23. 积极治疗传染源可以减少结核病的传播 • 涂阳病人的传染性是涂阴病人的 4-20 倍 • 如果不给予治疗一个涂阳病人可以传染10-15人/年 • 如果不给予治疗涂阳病人更容易死亡 Rouillon A. Tubercle 1976;57:275-99

24. 结核病变在体内的演变和播散

25. TB和HIV 双重感染 TB and HIV co-infection • 在没有HIV感染的人群中，结核杆菌感染者在其一生中 大约有10%的人会发病 • In the absence of HIV, about 10% of people infected with TB will develop TB disease. • 在TB/HIV双重感染者中约50%的感染者会成为结核病患者 • In people co-infected with HIV and TB, about 50 % may develop TB disease • TB 加速和恶化 HIV/AIDS的疾病进展 • TB accelerates the progression of HIV disease

26. TB和HIV 双重感染 TB and HIV co-infection (cont’) • TB是PLWHA人群中的主要致死原因 • TB is the leading cause of death in people living with HIV&AIDS • 不管是否感染HIV，结核病是可以被治愈的传染病 • TB can be cured whether a patient is co-infected with HIV or not, with the same treatment regimen

27. 问 题 Problems 低治愈率 Low cure rate 高死亡率 High mortality rates during treatment 高复发率 High rates of TB recurrence

28. 问 题 Problems （cont’)  涂阴肺结核的过诊 Over-diagnosis of sputum smear-negative PTB  涂阳肺结核的漏诊 Under-diagnosis of sputum smear-positive PTB  肺外结核病的误诊 Missed diagnosis of extra-pulmonary TB

29. International standards for Tuberculosis care 结核病关怀----国际标准 Diagnosis:

30. 诊 断 Diagnosis 标准 1. 所有不能解释的进行性、持续咳嗽2-3周的可以症状者都应该进行结核病相关检查 STANDARD 1. All persons with otherwise unexplained productive cough lasting two–three weeks or more should be evaluated for tuberculosis.

31. 诊 断 Diagnosis 标准 2. 所有肺结核的可疑症状者都应该进行痰涂片显微镜检查（至少两次痰涂片检查，至少包含一份晨痰） STANDARD 2. All patients (adults, adolescents, and children who are capable of producing sputum) suspected of having pulmonary tuberculosis should have at least two, and preferably three, sputum specimens obtained for microscopic examination.When possible, at least one early morning specimen should be obtained.

32. 诊 断 Diagnosis 标准 3. 所有的肺结核可疑症状者，都应该对其病变部位来源的合格标本进行显微镜涂片检查，如果条件允许可以做培养和组织病理学检查。 STANDARD 3. For all patients(adults, adolescents, and children) suspected of having extrapulmonary tuberculosis, appropriate specimens from the suspected sites of involvement should be obtained for microscopy and, where facilities and resources are available, for culture and histopathological examination.

33. 诊 断 Diagnosis 标准 4. 所有胸部影象学检查可疑肺结核的病人，应该对其痰标本进行微生物学检查。 Standard 4. All persons with chest radiographic findings suggestive of tuberculosis should have sputum specimens submitted for microbiological examination.

34. 诊 断 Diagnosis 标准 5. 涂阴肺结核的诊断标准：至少3个痰涂片检查阴性；胸部影象学检查可疑肺结核；对广谱抗生素试验性治疗无效（除外喹诺酮类）。对这样的病人如果条件允许，应该做培养；对已知或疑似HIV感染者，应加快对其的诊断进程。 STANDARD 5. The diagnosis of sputum smear-negative pulmonary tuberculosis should be based on the following criteria: at least three negative sputum smears (including at least one early morning specimen); chest radiography findings consistent with tuberculosis; and lack of response to a trial of broad-spectrum antimicrobial agents. (NOTE: Because the fl uoroquinolones are active against M. tuberculosis complex and, thus, may cause transient improvement in persons with tuberculosis, they should be avoided.) For such patients, if facilities for culture are available, sputum cultures should be obtained. In persons with known or suspected HIV infection, the diagnostic evaluation should be expedited.

35. 诊 断 Diagnosis 标准 6. 对有症状的涂阴儿童胸腔结核患者的诊断应该根据胸部影象学检查可疑肺结核、暴露史或结核感染（TST阳性或 γ干扰素释放试验）。对这样的病人如果条件允许，应该通过（排出物、洗胃或引痰等方式）得到痰标本进行培养。 STANDARD 6. The diagnosis of intrathoracic (i.e., pulmonary, pleural, and mediastinal or hilar lymph node) tuberculosis in symptomatic children with negative sputum smears should be based on the finding of chest radiographic abnormalities consistent with tuberculosis and either a history of exposure to an infectious case or evidence of tuberculosis infection (positive tuberculin skin test or interferon gamma release assay). For such patients, if facilities for culture are available, sputum specimens should be obtained (by expectoration, gastric washings, or induced sputum)for culture.

36. 当前可得的结核病诊断方法 What methods are available now to detect TB  涂片显微镜检查 (Microscopy) ZN FM  培养 (Culture) Conventional media MGIT BACT -3D ALERT ESP etc.  核酸扩增法 （NAAT） Amplicor MTB、MTD Gen-Probe、SDA Quanti-PCR Genechip  血清学方法 (Serological method) QuantiFERON T-SPOT TB ELISA etc.  其他 (Other) FAST-Plaque(phage) HPLC etc.

40. 传统的结核病实验室检查方法 #Capacity to detect when ≥10,000 bacilli per ml sputum * Capacity to detect when ≥ 102-3 CFU per ml sputum Stain # Culture* TST ZN FM Solid Liquid PPD Sensitivity 40-60% 50-70% 85% 70-85% ? Timing 48hours 48hours up to 8 weeks 2weeks 72hours Cost cheap expensive cheap expensive cheap

41. 管 盖 颜 色 临床用途 标本类 型 制 备 步 骤 添 加 剂 采血量(ml) Red 红色 血清生化 血清 采血后不需颠倒混匀→ 静置1小时→ 离心 无（内壁涂有硅酮） 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.0, 10.0,15.0,20.0 Orange 桔红色 快速血清 生化 血清 采血后立即颠倒混匀8次 →静置5分钟→离心 促凝剂：纤维蛋白酶 3.0, 5.3, 7.0 Green 绿色 快速血浆 生化 血浆 采血后立即颠倒混匀8次 →离心 抗凝剂:肝素钠、锂、氨 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 10.0 Gold 金黄色管 快速血清 分离生化 血清 采血后立即颠倒混匀5次 →静置30分钟→离心 惰性胶体促凝剂 2.5, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 9.5, 11.0,13.0 White 白色 分子生物学诊断 血浆 采血后立即颠倒混匀8次 室温离心1100g， 10分钟 抗凝剂K2EDTA 和惰性分离胶 5.0 Lavender 紫色 血液学 常规试验 全血 采血后立即颠倒混匀8次 →试验前混匀标本 抗凝剂:K2EDTA或K3EDTA 2.0, 2.5, 3.0,3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 10.0 Lt Bule 浅兰色 血液凝固 试验 全血 采血后立即颠倒混匀8次 →试验前混匀标本 抗凝剂:枸橼酸钠与血样比为1:9 1.8, 2.0, 2.7, 4.5 Black 黑色 血细胞沉 降率试验 全血 采血后立即颠倒混匀8次 →试验前混匀标本 抗凝剂:枸橼酸钠与血样比为1:4 1.8, 2.4, 4.0, 5.0 真空采血管使用指南

43. 痰涂片显微镜检查 • Z-N 萋尼二氏染色, 需要 5,000-10,000 个CFU/毫升 • 100x 油镜看完300个视野大概需要15分钟 • 40-70% 灵敏度, 90%特异性 • FM 荧光染色 • 灵敏度较ZN染色高10%

44. Good Smear Poor Smear Uneven Too thick Sloughed off Underdecolorized

45. 萋尼氏染色

46. 不同痰标本呈现的物理性状

47. 唾液

48. 脓痰

49. 血痰

50. 粘液痰（水样）