大豆蛋白的提取与含量测定

1. 大豆蛋白的提取与含量测定 指导老师 赵建军 曲宁 夏婷 孟繁新

2. 酸碱 酶 离子交换层析 电泳 蛋白质 极性 电荷 分子量 形状 离心 凝胶层析 蛋白质性质与应用技术关系图 肽 氨基酸 疏水性 亲水性 纸 层 析

3. 一、大豆蛋白的提取 目的要求 • 1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 • 2 、计算粗提产率 • 2、学习计算蛋白质收率 实验原理大豆中含有丰富的蛋白质、根据提取方法及其其性质的不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。 • 称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。

4. 试剂和器材 • 1、试剂 • （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH • （3）75%乙醇（4）6mol/L HCL • （5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH • 2、器材 • （1）离心机（2）烧杯 （3）滴管 • （4）PH试纸等

5. 操作方法 • 1、水抽提 • 将豆粉5g用约50毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提15min， 3800r/min离心15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液1毫升稀释100倍留做蛋白测定。 • 其余上清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌），用6mol/L和1 mol/LHCL，调PH4.5~5.0，3800r/min，离心15min，收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，放入表面皿上，60度烘干，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产率。

6. 蛋白质产物重量 • 蛋白质产率= ×100% • 原料总重量 • Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分

7. 二、Folin酚法测定蛋白质含量 • 目的要求 • 掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法 • 实验原理 • 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。 • Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。

8. 由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度成正比。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度成正比。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。 • 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。 • Folin酚法有不少个别改进的操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上、保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。

9. 试剂和器材 1、材料： • 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。 2、试剂： • （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 • （2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 • （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g • NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； • 称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月。

10. 4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色瓶中保存，可使用多年。4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色瓶中保存，可使用多年。 • 上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的浓度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。

11. 3、器材： • 试管10支 • 试管架一个 • 移液管：（5ml、1ml） • 移液管架 • 洗瓶 • 恒温水浴 • 723型分光光度计

12. Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取6支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定K=0.308 B=--0.009 R*R=0.9909

13. 2、样品测定：取三支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml和空白 ，如下操作：

14. 3.蛋白质浓度的计算： • A650值对应的mg数(Pr) Pr(mg/ml)= ×稀释倍数 • Pr溶液的ml数 • 思考题 • 1、采用Folin的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？ • 2、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。