第一节酶活性测定的基本知识

第七章酶学分析技术 第一节酶活性测定的基本知识酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质。它在体内含量极微，每ml仅为pg水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，称为相对定量法。

一、酶活性的概念和单位 （一）酶活性的概念酶活性是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量。即酶反应的速度。如果在酶反应过程中测得的产物[P]或底物[S]的变化量对时间作曲线可得到酶促反应时间进行曲线。

反应最初阶段，[S]过量，原始浓度很大。[P]或[S]的变化量随反应时间而线性地增减，即单位时间内[P]或[S]的变化量或反应速度是恒定的，此阶段称为零级反应期。一般情况下，产物和底物的变化量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，因产物是从无到有，只要测定方法足够灵敏，准确度很高。

（二）酶活性单位 酶活性大小通常以单位来表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，酶单位有三种表示方式。 1. 惯用单位60年代前，各种酶活力的表示法和酶单位定义没有统一标准，一般由方法的设计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产物为一个单位。这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不同单位定义，如ALT的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位的定义不同，正常参考范围也不同。

King法 每100ml血清在37℃与底物作用60min，每生成1μmol丙酮酸为一个酶活性单位。 Mokum法1ml血清37℃与底物作用60min每产生5μg丙酮酸为一个酶活性单位。 Reitmen法套用Karman单位，在规定条件下（血清1ml，反应液总量3ml，25℃，作用1min内径1cm比色杯）测定340nm波长处，吸光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。

2. 国际单位1961年国际生化学会酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU）是指在规定条件下（如25℃，最适pH，最适[S]时）每分钟催化1μmol底物发生反应的酶量。 1965年改为30℃，1972年取消对温度的规定。

缺点： （1）由惯用单位换等成IU较麻烦。（2）对分子量不明的底物无法计算其摩尔浓度。（3）同一种酶用不同的测定方法，换算成国际单位后仍不相同。

3. Katal单位 为了与法定计量单位（SI）接轨，1972年国际酶学委员会又提出的一种新单位，是指在最适条件下，每秒使1mol底物发生变化的酶量。 1 Kat=60×106IU 1 nKat=0.06IU 1 IU=16.67nKat

（三）酶的比活性 是指单位质量的蛋白质所具有某种的活性，用酶活性单位/mg蛋白质来表示，比活性是衡量酶纯度的一个指标，比活性高，表示酶制剂中杂蛋白的含量少，酶纯度高。

二、酶活性单位的计算 酶活性单位的计算，实际上就是计算单位时间内底物或产物的变化量。计算公式

如血清淀粉酶测定（碘比色法）缓冲淀粉液，0.4g/L，用量1.0ml，血清0.02ml。如血清淀粉酶测定（碘比色法）缓冲淀粉液，0.4g/L，用量1.0ml，血清0.02ml。单位定义100ml血清37℃，作用15min每水解5mg淀粉为一个淀粉酶单位。

如ALT测定速度法 NADH在340nm的摩尔吸光系数为6300,反应液（工作液）1.0ml，血清0.1ml，光径1cm。

反应速度 C A 延滞期 B 线性期 C 偏离线性期 B A 反应时间 t 三、酶促反应进程酶促反应不同于一般催化反应，反应不是瞬时完成的，而是经过一个进程。

酶活性测定原理 酶活性测定不论采用何种方法，都必须符合两个原则。（1）在零级反应期测定v＝Vmax＝常数，即－ [S]或[P]与反应时间成正比。保持过量底物。（2）反应速度与酶量成线性关系。

反应级数 0级 Ⅰ级 [ P ] [ S ] 反应时间 t 酶促反应时间进程曲线

四、酶促反应底物动力学 （一）米—曼公式酶的活性除了受温度pH，抑制剂，激活剂等因素的影响外，还受底物浓度的影响，1913年michacli-memten根据酶作用的中间产物学说，定量地分析了酶反应速度与底物浓度的关系，其数学表达式为：

（二）Km的意义和应用 1. Km的意义Km是3个速度常数的复合函数，在数值上相当于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。当 Km＝[S] Km可表示酶与底物的亲和力，Km越大，表示E与S的亲和力越小反应，Km越小表示酶与S的亲和力越大。

Km是酶的特征性常数之一，只与酶的结构底物性质以及反应条件（如温度、pH、离子强度）有关，而与酶的浓度无关，各种酶的Km一般在10－6～10－3mol/L之间Km是酶的特征性常数之一，只与酶的结构底物性质以及反应条件（如温度、pH、离子强度）有关，而与酶的浓度无关，各种酶的Km一般在10－6～10－3mol/L之间竞争性反竞争性非竞争性 Vm 不变降低降低 Km 增大减小不变

2. Km的应用 （1）计算不同[S]时v为Vm的百分率如[S]＝10 Km时（2）确定酶反应中的底物浓度为了使酶反应的速度接近Vmax一般要求[S]＝10～20 Km，此时v＝91％～95％Vmax。

（3）作为鉴别酶的依据 如两种酶对同一底物（相同条件下）表现有相同的Km，则这两种酶为同一种酶，否则为两种不同的酶。（4）确定酶的天然底物有些酶可有多种底物，其中Km最小的底物是该酶的最适（天然）底物。（5）判断酶的激活剂或抑制剂凡能降低Km的物质为激活剂，凡能增大Km的物质为酶抑制剂。（6）鉴别酶的抑制类型根据抑制剂以对Km和Vm的琐影响，可区分抑制类型。

（三）Vmax的意义和应用Vmax是指酶完全被底物饱和时的反应速度，在[E]不变时，对于特定的底物、Vmax也是一个常数。（三）Vmax的意义和应用Vmax是指酶完全被底物饱和时的反应速度，在[E]不变时，对于特定的底物、Vmax也是一个常数。如果已知酶的总浓度，则可从Vmax来计算酶的转换率，转换率可代表酶的催化效率，指单位时间内每分子酶所能催化反应的次数。大多数酶的转换率为1～104s－1

（四）Km和Vmax的测定 将[S]对v作用不能求得Km和Vmax这是因为Vmax是一个渐近的极限值，不可能从实验中直接得到，由于Km是v为Vmax一半时的[S]，所以也不能得到Km，一般都将米一曼公式演变成直接方程，然后根据直线方程斜率用标准法求得Km和Vmax。

第二节酶活性测定方法及酶学分析类型 酶学分析是20世纪70年代发展起来的一类检测技术，包括酶活性测定和底物浓度测定两大类型。酶活性的测定方法包括终点法和连续监测法。一、酶活性的测定方法根据酶的时间，酶活性测定分为两种类型。

1. 终点法（end-paint amalyin）测定酶 反应开始后某一段时间内(从t1→t2)产物或底物的总变化量称为终点法。而t1和t2是反应历程中的两个点，故又称两点法。

优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。缺点：无法了解这段时间的反应是否都是零级反应，故难以保证结果的真实性。

2. 连续监测法（continuoue monitosing） 每隔一定时间（10～60s）连续测定酶反应中产物或底物的变化量称为连续监测法。又称动力法或速率法，终点法的测定两个时间点，该法进行多点连续测定。

优点：多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。优点：多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。缺点：分光光度计必须有保温装置，而且P或S应是可直接测定的化合物，如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。

三、影响酶活性测定的因素 （一）样品处理的影响 1. 溶血RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。 2. 抗凝剂某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用血清。 3. 样品存放时间，各种血清酶稳定性不同，如ACP、CK在室温下迅速失活，AMS、GGT则很稳定。

（二）测定条件的影响 1. 温度温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快，同一般化学反应，其关系符合Arrhenius公式K=Ae 。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。

（1）温度的选择37℃反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学较难定在30℃进行，IFCC建议30℃作为参考方法的标准温度。（1）温度的选择37℃反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学较难定在30℃进行，IFCC建议30℃作为参考方法的标准温度。（2）温度系数将温度每升高10℃后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数(Q10)。Q10表示温度对反应速度影响的大小。

2. pH （1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合。（2）改变酶活性中心必需基因的解离状态，影响酶活性。（3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。（4）使亚基解聚

3. 缓冲液性质 酶活性下仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。（1）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的Ph。如ALT测定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH测定pH8.8，（二乙醇胺pka8.8）ALP测定pH10（碳酸pka10.32）。

（2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。（2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。（3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏。（4）缓冲液在可见光区或紫外区没有成仅有极低光吸收现象。

第三节同工酶测定 一、同工酶的概念 1971年国际生化学会（IUB）提出同工酶是指同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体，纯聚体或杂交体，其生物性质不同但能催化相同反应的酶。同工酶的分布除了具备组织器管特异性外，在同一细胞的不同细胞器中也有不同的分布，这对于提高疾病的诊断有重要意义。

分离方法 （一）电泳法：常用的电泳材料有醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。（二）层析法主要有两种 1. 离子交换层析利用同工酶表面电荷的不同，与离子交换树脂结合，常用的离子交换剂有二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）、二乙氨基乙基葡聚糖A-50（DEAE-SephadexA-50）等。

2. 亲和层析法 利用多基因位点的同工酶具有不同免疫学特性和不同底物专一性，将特异性配体（如抗体）用固相化技术结合在葡聚糖或琼脂糖凝胶上，样品通过层析柱时，凝胶就能选择性结合某一同工酶，而让其他同工酶通过，然后用洗脱剂洗脱。评价可用于同工酶的提纯制备，但费时。

（三）免疫化学法 利用同工酶的抗原性不同进行分离，主要适用于基因位点的同工酶。 1. 免疫抑制法利用同工酶的某一亚基与相应抗体结合后，酶活性受抑制，而不含这种亚基的同工酶不受影响。故测定加与不加抗体样品中酶活性的差别，可推并且该型同工酶的活性，如在CK同工酶中加入足备的CK-MM抗体，则： CK-MM活性全部被抑制 CK-MB活性抑制50％ CK-BB活性不受影响

2. 免疫沉淀法 在含有A、B两型同工酶的混合样品中，加入A（或B）的抗体，使A（或B ）沉淀，离心后测定上清液中酶活性，可代表B（或A）的酶活性，用加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即得出被沉淀酶活性。 3. 免疫测定酶蛋白法酶是蛋白类抗原，可用各种免疫定量法来测定，火箭电泳法、放射免疫法（RIA）、酶免疫法（EIA），其中后两者灵敏度可达10－9～10－12g水平。评价 RIA是目前测定同工酶最可靠、灵敏和特异的方法，但方法较复杂，有放射性污染。

（四）动力学法 1. 利用同工酶对底物专一性不同进行分离如A型醛缩酶（ALD-A）对FDP和F-1-P的活性比值为50，而B型醛缩酶（ALD-B）对FDP和F-1-P的活性比值为1。根据此样品对FDP和F-1-P的活性比值，可大致反映其ALD-A和ALD-B的比例。

2. 利用同工酶有不同的最适pH和不同底物的Km进行鉴定如AST的最适pH为7.4，当pH为6.5时，血浆AST（s-AST）活性明显下降，而线粒体AST（m-AST）仍可保持。另一方面，m-AST对L-ASP的Km为0.7mmol/L，远小于s-AST的Km 5.07mmol/L，因此在pH6.5，L-ASP浓度为5mmol/L，测定的是m-AST活性，而在pH7.4，L-ASP浓度为200mmol/L，测定的是AST活性。评价简单快速，不需特殊设备，也不需分离同工酶就可测定，但准确性较差。

（五）热失活法 利用各型同工酶对热稳定性不同而设计的方法。如ALP同工酶的热稳定性依次为：ALP4>ALP2>ALP5>ALP3 当血清在60℃加的热30mim，其它同工酶都以失活，而ALP4仅失活5％。评价最简单易行，不需任何外加试剂特殊仪器，但准确性差，不能准确定量，只能大致估计。

三、同工酶测定的临床意义 同工酶谱的改变能较准确地反映病变的部位和操作程度，对提高疾病的诊断、治疗以及预活分析有重要价值。

GOD G6PD POD CK HK 二、工具酶（一）工具酶的概念作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶称为工具酶。 G+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2 H2O2 +4-AAP+酚红色醌类化合物 C～P+ADP C+ATP ATP+G G-6-P+ADP G-6-P+NADP+ 6-磷酸葡萄糖酸+NADPH

常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。（二）工具酶的质量要求工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。

（三）常用工具酶及其指示反应。 1.NAD(P)＋或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应，最常用的工具酶有LDH、MDH、GLDH、G6PD，它们都以NAD(P)＋或NAD(P)H为辅酶。NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。如 ALT测定工具酶是LDH

主要缺点： （1）需要紫外分光光度计（2）需高纯度的酶和辅酶（3）灵敏度较低 NADH在340nm，ε为6300L·mol－1cm－1改进方法，在脱氢酶后再偶联一个心肌黄酶，用四氮唑衍生物作为受氢体，生成紫色的甲臢。 NADH＋心肌黄酶-FAD→NAD＋＋心肌黄酶-FADH2 心肌黄酶-FADH2+INT→心肌黄酶+甲唧 INT生成的甲臢最大吸收峰492nmε19400L·mol－1 cm－1约为NADH在3400m吸光系数的3倍。

2.偶联H2O2的工具酶及指示反应 GOD、尿酸酶、GlyOD、ChOD等工具酶可分别作用于G、UA、GLy、ch使氧化产生H2O2， H2O2在POD的作用下，使无色的色原氧化成有色的色素。常用的单一色原联苯胺、邻联甲苯胺、邻联茴香胺，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，有致癌作用，现已不用。

成对色原有4-氨基安替比林和酚，是Trinder 1969年提故称为Trinder反应，是目前最常用的指示反应。 H2O2 +酚+4-AA 红色亚胺醌其吸收峰为500nm，ε为13L.mmol-1cm-1 优点：呈色稳定，线性范围宽，应用广。缺点：易受vitC、胆红素、尿酸等还原性物干扰，这些物质能还原H2O2，使结果偏低。 POD

三、底物浓度测定 1.终点法将待测底物和工具酶保温一定时间后，待测物全部转变为可直接检测的化合物，从而计算待测物浓度。如：尿素+H2O 2NH3+CO2 产生的NH3与尿素的浓度成正比。由于体液中待测物浓度不高，一般在工具酶Km附近，为了缩短反应时间，实现底物完全转变，可在反应体系中加入“陷阱试剂”使之与反应产物结合，减少逆反应。脲酶

2.速率法 这种方法不要求将待测物全部转变为可检测的产物，而是利用工具酶的反应速度来测定待测物的浓度。速率法较终止法简便、省时、干扰少，可测定低浓度物质，需自动分析仪。

第一节 酶活性测定的基本知识