1 / 42

Скрининг – предвзятый и непредвзятый

chiara
Download Presentation

Скрининг – предвзятый и непредвзятый

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наукТанас Александр СергеевичАнализ дифференциального метилирования геномовметодами непредвзятого скрининга03.02.07 «генетика»03.01.09 «математическая биология, биоинформатика»Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наукНаучный руководительк.б.н. В.В. Стрельников

  2. Скрининг – предвзятый и непредвзятый • Скрининг дифференциального метилирования ДНК – систематическое выявление локусов генома, отличающихся характером метилирования в различных типах клеток. • Непредвзятый скрининг (hypothesis free) планируется в отсутствие любых предварительных гипотез. • Предвзятый скрининг (hypothesis driven) основывается на предварительном теоретическом отборе спектра анализируемых участков, после чего дифференциальный характер их метилирования подтверждается либо отвергается.Основная гипотеза: дифференциальное метилирование характерно для участков промоторных CpG-островков в области +/-200 (до 500) п.н. от сайта инициации транскрипции.

  3. Преимущества непредвзятого скрининга • расширяет фундаментальные представления о характере и роли метилирования различных структурно-функциональных элементов геномав норме и при патологии • способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров

  4. Возможности применениянепредвзятого скрининга Ограничены использованием клонирования и секвенирования для геномного картирования выявленных дифференциально метилированных локусов. секвенирование генома человека математическое моделирование альтернативный способ картирования

  5. Цель исследования Разработать подходы к анализу дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга.

  6. Задачи исследования • Разработать современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов. • Разработать способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК, исключающий необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования. • Разработать алгоритм и компьютерную программу моделирования результатов экспериментов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей. • Охарактеризовать иерархию продуктов АИМС и описать количественные и качественные параметры продуктов АИМС, получаемых при различных экпериментальных условиях. • Провести сравнительный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы на основе разработанного алгоритма скрининга дифференциального метилирования.

  7. Обобщенная схема метода скрининга дифференциального метилирования геномов • Формирование выборки участков генома • ферментативный гидролиз • аффинное обогащение • Сокращение выборки • редкощепящие рестриктазы • удлинители универсальных праймеров • Сравнение профилей • вычитательная гибридизация • сравнение визуализированных репрезентаций • Разделение элементов выборки • электрофорез • разведение • Картирование • клонирование и секвенирование • по положению на матрице Метод непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов

  8. Требования к оптимальному методу скрининга • непредвзятый характер скрининга • возможность стандартизации (моделирования) • простота и экономичность метода • высокая производительность • быстрое и несложное картирование АИМС(амплификация интерметилированных сайтов)

  9. SmaI C C C G G G G G G C C C SmaI C C C G G G G G G C C C XmaI C C SmaI G G G G G G C C C C С С C C G G G G G G SmaI XmaI C C C SmaI G G G C C C C G G G XmaI C C C C G G G G G G C C C XmaI SmaI

  10. Модификации этапов АИМС Выбор рестриктаз по результатам компьютерного моделирования Выбор удлинителей по результатам компьютерного моделирования Капиллярный электрофорез флуоресцентно меченых продуктов Компьютерные инструменты анализа и сравнения электрофореграмм Картирование на основе шаблона выборки 10

  11. AIMS in silico 11

  12. Определение геномной принадлежности PHF-5’-CpG Межгенный13q32.1-CpG C2CD2-5’-CpG 12

  13. Планирование сокращения выборки Уменьшение количества продуктов АИМС в 5 раз для С,G в 3 раза для A,T (Frigola et al., 2002) 13

  14. другие C,G богатые участки: 5 CpG островки: 66 3'-CpG- промоторныеНЕ межгенные островки; 6 CpG-островки; 2 CpG-островки; 12 внутригенные 5'-CpG CpG-островки; 15 не CpG-островки; 3 островки; 33 Состав геномной выборкиCCG-АИМС 14

  15. Анализ геномов клеточных линий РМЖ 15

  16. Картирование выявленных дифференциально метилированных локусов 16

  17. Карты метилирования ccg177.2 межгенный CpG-островок 13q32.1 ZR-75-1 MCF7 17

  18. Карты метилированияccg189 C2CD2 (1 экзон) MCF7 18

  19. Результаты валидации 19

  20. Результаты валидации HBL-100 ccg168 ANK3 T-47D 20

  21. MS-SSCA ccg168 ANK3 1 2 4 3 5 6 7 21

  22. Геномная локализация дифференциально метилированных участков 22

  23. Выводы • Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации интерметилированных сайтов – АИМС) и высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного электрофореза с математическим моделированием экспериментов позволило разработать современный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов. • Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного математического моделирования, исключает необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов АИМС в процессе определения их геномной принадлежности. • Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека. 23

  24. Выводы • Проведенная характеристика иерархии продуктов АИМС и полученные описания количественных и качественных параметров репрезентаций АИМС для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование экспериментов АИМС. • Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR‑75‑1, HBL‑100, HS 578 T, BT‑474, MCF7 и T‑47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга. 24

  25. Спасибо за внимание

  26. Метилирование неканонической локализации

  27. Сравнение результатов с БД

  28. Оценка точности программы Модель: • 30000 соматических мутаций • 35000 п.н. в продуктах АИМС • 1300 п.н в сайтах SmaIи удлинителя • случайное равномерное распределение мутаций • геном 3.3*109 п.н. анализ образца без метилчувствительной рестрикции 28

  29. Потенциал трехнуклеотидных удлинителей 29

  30. Порядок этапов МЧ-РДА Создание репрезентации Редукция(естественная) Сравнение: вычитательная гибридизация Разделение: разведение, клониро-вание Определение геномной принадлежности: секвенирование * МЧ-РОГС Создание репрезентации Редукция:редкощепящая рестриктаза Разделение: электрофорез * Сравнение Определение геномной принадлежности: секвенирование Methyl-Seq Создание репрезентации Редукция:(естественная) Разделение: разведение Определение геномной принадлежности * Сравнение 30

  31. Карты метилированияccg168 ANK3(1 интрон) HBL-100 31

  32. Скрининг дифференциального метилирования 32

  33. Патентная активность Медицинская ДНК-технология Скрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса Компьютерная программа 50201050017 от 16.09.2010 AIMS in silico Компьютерная программа 50201050040 от 13.10.2010 PeakPick 33

  34. Калибровка электрофореграммыпо маркеру молекулярной массы 34

  35. Анализ метилирования ДНКиз клеток линии Jurkat, культивированных в присутствии5-Aza-dc 35

  36. 0,9 kb promoter intron 1 exon 1 promoter CpG island Карта метилирования CpG-островка BIN1 36

  37. 37

  38. XmaI 5’- C C C G G G 3’- G G G C C C адаптер 5’- A T T C G C A A A G C T C T G A C C G G G 3’- C T A A G C G T T T C G A G A C T G G C C 5’- A T T C G C A A A G C T C T G A C C G G G C C G -3’ универсальный праймер удлинитель Универсальный праймер с удлинителем 38

  39. Состав геномных выборок АИМС SmaI-GCG, SmaI-CCG 39

  40. Неденатурирующийкапиллярный электрофорез 40

  41. Анализ электрофореграммпрограммой GeneMapper 41

  42. Распределение сайтов узнавания SmaI и HpaIIв геноме человека 42

More Related