第二十六章 RNA 生物合成和加工

1. 第二十六章 RNA生物合成和加工 本章重点讨论RNA的生物合成，对RNA的合成后加工和RNA的复制作一般介绍。 第一节 DNA指导下RNA的合成（转录） 第二节 RNA转录后加工 第三节 RNA指导下RNA的合成(RNA的复制) 第四节 核酸生物合成的抑制剂 思考 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

2. 复制 DNA 转录 逆转录 蛋白质 RNA 翻译 复制 遗传信息传递的 中心法则 生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。

3. 第一节 DNA指导下RNA的合成 一、转录的概念 二、RNA聚合酶及催化反应 三、RNA合成过程 四、启动子和转录因子 五、终止子和终止因子 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

4. 转录的概念和DNA的有义链和反义链 转录是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照碱基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA的过程。RNA的转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止。此转录区域为一个转录单位。 模板链（template strand） 反意义链(antisense strand) 启动子（promoter) 终止子(terminator) DNA 5´ 3´ 3´ 5´ 有意义链(sense strand) 非信息区 转录与DNA复制的异同

5. 转录与DNA复制的异同 相同：要有模板，新链延伸方向5´→3´，碱基的加入严格遵循碱基配对原则。 相异：①复制需要引物，转录不需引物。 ②转录时，模板DNA的信息全保留，复制时模板信息是半保留。 ③转录时，RNA聚合酶只有5´→3´聚合作用，无5´→3´及3´→5´外切活性。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

6.  大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图     起始因子 核心酶(α2ββ) 全酶(αββ) β ——与模板DNA结合 β——与核苷酸底物结合 α——识别其相应的启动子？  ——识别DNA分子上的起始信号，不同启动子需要不同σ因子。

7. 细菌的RNA聚合酶，其活性形式(全酶)为15S，由5种不同的多肽链构成，按分子量大小排列分别为β'(155000)，β(151000)，σ(70000)，α(36500)和ω(11000)。每分子RNA聚合酶除有两个α亚基外，其余亚基均只有一个，故全酶为β'βα2σω(450000) 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

8. 3´ 5´ RNA聚合酶催化的反应 U 5´ A G C 真核细胞中的RNA聚合酶 C G A U 3´ 新合成RNA 模板DNA

9. 真核细胞中的RNA聚合酶 细菌只有一种RNA聚合酶，它完成细胞中所有RNA的合成。真核细胞的转录机构更加复杂。真核细胞核内产生三种RNA聚合酶，位于不同的部位，且均有复杂的亚基结构。每种酶负责不同种类基因的转录。

10. RNA聚合酶Ⅰ合成RNA的活性最显著。它位于核仁中，负责转录编码rRNA的基因(称rRNA)，而细胞内绝大部分RNA是rRNA。另一主要的酶是RNA聚合酶Ⅱ，它位于核浆中，负责核内不匀一RNA(hnRNA)的合成。而hnRNA是mRNA的前体。RNA聚合酶Ⅲ负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。转录抑制剂常用来区分这三类酶的活性。其中最主要的是一种双环八肽──α-鹅膏蕈碱。在不论何种真核细胞中，RNA聚合酶Ⅱ的活性均可被低浓度的α-鹅膏蕈碱所迅速抑制，而聚合酶Ⅰ却不被抑制。聚合酶Ⅲ对α-鹅膏蕈碱的反应则不尽相同:在动物细胞中聚合酶Ⅲ可被高浓度α-鹅膏蕈碱所抑制，而在酵母和昆虫细胞中则不会被抑制。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

11. 粗制的RNA聚合酶都是大而复杂的蛋白质，分子量达500 KD或更多。其亚基组成亦很复杂:每个酶分子有两个大亚基(一般说，一个约200 KD，另一约140 KD)，还有10个以下的小亚基，每个分子量约为10-90 KD。三种酶中也有一些共同的亚基，所以可能是一个原始的酶在进化过程逐渐分化为在复杂的真核细胞中执行不同功能的三种酶。直到现在还不能用亚基来重建活性的酶分子，因此还难以提出确切的证据说明这些亚基是否真正都是酶分子的固有的组成部分，也不知道哪些亚基负责催化，哪些负责调节功能。

12. 某些常用的转录抑制剂 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

13. 启动子（promoter) 终止子(terminator)     RNA聚合酶 5 离开 3    5 3 3 5 5 5 3 5 RNA合成过程 起始 双链DNA局部解开 磷酸二酯键形成 延长阶段 解链区到达基因终点 终止阶段 RNA

14. 转录终止信号 细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子(terminator)。终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。在终止子处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。在某些位点处，终止需要一种辅助蛋白质，即ρ因子，但在其他位点处，核心酶本身即可终止转录。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

15. 不依赖ρ因子的终止子有两个特征: [1]DNA顺序有双重对称(dyad)，位于RNA3´端之前15-20核苷酸处； [2]DNA模板链中有一串约6个A，转录为RNA3´端的U。 双重对称的意义在于其转录本能形成发夹结构。体外实验显示，如果掺入其他碱基以阻止发夹形成时，终止即不发生。通常只要有一个核苷酸的改变破坏了规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。对终止子突变的分析亦显示DNA模板上多聚dA顺序的重要性。如将此序列中的一个碱基换掉，或除去部分序列(缺失)都可使终止子失活。

16. 依赖ρ的终止子没有不依赖ρ的终止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成稳定的发夹。现在还不清楚ρ因子的作用机制，但有几种可能性:[1]ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，说明它能与新生RNA链结合，并可能应用ATP放出的能量将RNA链从酶和模板中释出。[2]ρ因子可能与RNA聚合酶结合。编码ρ因子的基因rho发生突变时产生的某些ρ蛋白质仅能在RNA聚合酶的β亚基也发生相应突变时才能有RNA合成的活性。[3]已知RNA聚合酶本身能识别DNA模板中依赖ρ的终止顺序，而ρ因子是在以后才发挥作用而释出RNA的。即使是在没有ρ时，RNA聚合酶也在依赖ρ的终止子处暂停，不过以后仍继续向前进。故有人认为，即使有一个很弱的发夹也可使RNA聚合酶停止前进。此时ρ因子即可与之结合而将聚合酶和RNA解离下来。所以ρ因子也是一种酶。

17. 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

18. 模板 5'-CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA-3' 3'-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTTGTTTT-5' 5'-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH3' 转录本 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

19. σ因子的解离 RNA链的延伸阶段开始后，σ因子即从核心酶-DNA-新生RNA复合体上解离下来，并可再用于和新的核心酶结合，一般认为，σ因子之所以被释放出是因为此时它已不起作用了，但也可能是因为σ因子如仍然存在将会造成RNA聚合酶与启动子序列结合过紧，以致不能再沿着模板移动。所以当新生链-酶复合体与DNA模板的结合很弱，并且酶亦不再要求与特异序列的DNA结合时，链的延伸才能达到最佳状态。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

20. 虽然全酶与启动子的结合要比核心酶与任何DNA顺序的结合紧密得多，但对非启动子DNA的结合却可能并不如此。因此，σ因子能抑制RNA聚合酶与DNA的非特异性结合，促使酶分子沿着螺旋轻快地旅行，直到它很快找到合适的启动子序列。通过沿着DNA向着一个方向前进，全酶就可以比它在细胞内空间的三维方向中更快得多地找到启动子。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

21. 因为正在转录的RNA聚合酶没有σ因子，而且在正常生长条件的细胞中可能仅有半数的酶分子是有活性的，所以没有理由认为细胞中核心酶分子和σ因子的数目是相等的。然而两者的数目不会相差过大;可能细胞内总是保持有相当数量的游离σ因子，以便一旦核心酶在转录终止而释放出来时能立即重建为全酶。

22. RNA合成的起始 在E. coli中，RNA链的起始通常是在RNA聚合酶所结合的DNA区域的一端，在解开的双链部分，离-10开始处大约12或13个碱基处。第一个核苷酸通常是pppA或pppG, 较少为pppC，但偶而亦可为pppU。有时转录可在好几个相邻核苷酸处起始，也就是说RNA聚合酶似乎是可屈伸的，它能覆盖和巡游解链区的一部分，设法找出一个嘌呤作为起始，而嘧啶是它的第二选择。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

23. 然而从细胞内分离出的RNA分子的5'端的核苷酸却不一定是起始转录的核苷酸。因为在合成后许多RNA链还要经过内切核酸酶加工，切成较小片段，而这些片段完全可以由嘧啶起始。例如，虽然某些tRNA链的起始是U，但它们从不含有末端三磷酸基团。它们是在体内由长链RNA切割而成的。实际上所有细胞均含有许多种核酸酶，实验室中在体外合成的RNA则往往不受核酸酶的作用。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

24. DNA的解链和重复螺旋化 RNA聚合酶在延伸新生RNA链时继续使DNA螺旋解链，以便暴露出模板链，RNA链的生长点是大约12bp长的RNA-DNA杂交区。在RNA链离开模板时，此杂交区即复原，同时两条DNA链即又重复螺旋化。而被延伸的酶所解开的DNA链的长度约为17bp，略长于RNA-DNA杂交链，而与在启动子形成的“开放”复合体的解链区的长度相等。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

25. 虽然一般说延伸复合物可保持17bpDNA于解链状态，但此数目可以有很大的改变，特别是当RNA聚合酶遇见一些特殊的DNA序列时。例如，在转录终止区，DNA链可完全重复螺旋化，而酶的RNA链则从复合体中释放出。而在质粒ColEL复制时，RNA引物的转录生成的情形则正相反，在某一特异位点处DNA的重复螺旋化被阻止，生成的转录本和模板DNA形成几百核苷酸长的RNA-DNA杂交双链。目前还不知道为什么会有这样的变化，可能新生成的转录本的特异的二级结构起很大的作用。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

26. 模板链（反义链） 有义链 解链 复链 3´ RNA-DNA杂交螺旋 新生RNA 聚合酶的移动方向 延长部位 5´ RNA链的延伸图解 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

27. 真核生物和原核生物转录的差别 真核生物中转录与复制在不同的区域 RNA聚合酶不相同  启动子不同  转录后RNA加工修饰不同 DNA mRNA前体 加工 mRNA 核 mRNA 转运 核糖体 新生蛋白质 原核生物 真核生物

28. 四、启动子和转录因子 启动子( promoter)是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。 RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质）称为转录因子(transcriptional factor)。 利用足迹法(footprint)和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。 例：大肠杆菌启动子共有序列的功能 增强子

29. 增强子 增强子能大大增强启动子的活性。增强子有别于启动子处有两点:[1]增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动;[2]它能在两个方向产生相作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。首先被发现的增强子是SV40增强子。两个增强子位于基因组的两个串连的72 bp重复中，约在转录起始点上游200 bp处，每个72 bp重复中有一个。缺失实验显示两个重复缺失一个并不产生什么影响，而如两个均缺失即将大大降低活体内的转录。有人发现，如果将β珠蛋白基因放在含有72 bp重复的DNA分子中，它的转录作用在活体内将增高约200倍以上，甚至当此72 bp顺序位于离转录起点上游1400 bp或下游3000 bp时仍有作用。各个基因中的增强子顺序差别较大，但有一个基本的核心顺序(core sequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG

30. 调节蛋白与启动子的结合 启动子的效率高低不一。实验显示，与聚合酶结合和开放复合体形成这两个步骤的效率在不同的启动子中是不同的。因此，细胞内不同启动子的效率可有几个数量级的差别──从每10分种以上方有一次转录起始到每1-2秒即有一次起始。在不同的生长情况下转录可根据需要而改变。在E. coli中转录的调节常常是通过某些蛋白质的介导。这种调节蛋白能够在启动子处或靠近启动子处与DNA分子相结合，从而增高或降低RNA聚合酶起始RNA合成的效率。这些蛋白质中，有的能阻断RNA聚合酶的结合，从而抵制转录，称为阻遏蛋白(repressor); 有的能与RNA聚合酶结合并提高其活性，称为激活蛋白(activator)。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

31. 凡需要激活蛋白才能充分发挥作用的启动子常常与-35共同顺序很不相似，这提示激活蛋白可以取代这个结合位点。作为一种启动子的阻遏蛋白可能是另一种启动子的激活蛋白，反之亦然，这取决于其结合位点的准确位置。一种调节蛋白的名称常常只是反映了它第一次被发现时的功能。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

32. 常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。 启动子一般可分为两类: (1)一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子。这类启动子应当总是能被转录，但实际上也不都如此，外来蛋白质可对其有影响，即该蛋白质可直接阻断启动子，也可间接作用于邻近的DNA结构，使聚合酶不能和启动子结合。(2)另一类启动子在和聚合酶结合时需要有蛋白质辅助因子的存在。这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的DNA顺序。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

33. 因此，RNA聚合酶能否与启动子相互作用是起始转录的关键问题，似乎是蛋白质分子如何能识别DNA链上特异序列。例如，RNA聚合酶分子上是否有一个活性中心能够识别出DNA双螺旋上某特异序列的化学结构?不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同。这就可能调控转录起始的频率，亦即对基因表达的重要程度不同。DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。一个转录单位可以包括一个基因，也可以包括几个基因。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

34. 为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10 bp和35 bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下, -35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

35. 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

36. -10序列又称为Pribnow盒(原核生物)。在真核生物中相应的序列位于-35 bp处，称为TATA盒，又称为Goldberg-Hogness box，是RNA聚合酶Ⅱ的结合部位。-10和-35这两个部位都很重要: [1] RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主链中的磷酸基相接触; [2] 离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱; [3] 最重要的是，破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20 bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像，它能"感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状" 。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

37. 启动子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序。但是附近其他DNA顺序也能影响启动子的功能。例如，在核糖体RNA合成的起始位点的上游50到150核苷酸之间的顺序就是对启动子的完全活性所必需的。如果这一段DNA顺序缺失并由其他外来DNA所取代(例如克隆在质粒DNA中的rRNA基因)，则转录起始的频率将降低10倍。同样，在其他情况下，远隔部位的富有AT的DNA顺序被认为能增进转录起始的频率。有时候上游顺序可以是某些能直接激活RNA聚合酶的"激活蛋白"的结合部位。但是，上游顺序往往有另外的功能。例如上游顺序可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离，因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。

38. RNA聚合酶与启动子的结合 大肠杆菌的RNA聚合酶与启动子结合的过程可分为两步。[1]酶找到启动子顺序并与其以"关闭"复合体形式(即双螺旋形式)相结合。这一步所识别的是-35序列，因为-35序列的突变损害启动子的结合。[2]"关闭"复合体转变为"开放"复合体(即双螺旋被解旋，两条链分开);此时酶的结合比较紧密。在这个转变中-10区约有17bp被解旋，暴露出模板链。-10序列富于AT碱基对，因为AT对比GC对更易于"融化"。-10区的突变可阻碍"开放"复合体的形成。许多突变改变了-10序列中的碱基，但并未减低其AT对的水平，却仍然能阻碍其"融化"为开放复合体，可见-10区除了要易于融化之外，还必须有特异的形状，以便RNA聚合酶能够识别它。

39. 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

40. 足迹法确定启动子序列

41. Pribnow 框 5-9 bp 16-19 bp 识别区 A × × × × × × × × × × AAT× AAT× G × × × × TTGACA × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × ×AAT AACTGT T × × × × × × × × × × × × × ×TTA C -10 × × -35 × × 大肠杆菌启动子共有序列的功能 起点 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

42. 五、终止子和终止因子 提供转录停止信号的DNA序列称为终止子( terminator)。协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子 (termination factor)。有的终止信号的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越过终止子继续转录，这称为通读(read through)，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子(antiterminator)。 例：大肠杆菌的两种终止因子 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

43. 大肠杆菌两类终止子的回文结构 富含G-C 系列U A. 不依赖于Rho（）的终止子 A. 依赖于Rho（）的终止子

44. 第二节 RNA转录后的加工 一、RNA的加工 二、 RNA的拼接、编辑和再编码 三、RNA生物功能的多样性 四、RNA的降解 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

45. 不论原核或真核生物的rRNAs和tRNAs都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的，然后才能加工成为成熟的RNA分子。然而绝大数原核生物的mRNA却不需加工，仍为初级转录本的形式。相反，真核生物从断裂基因产生的mRNA要经过复杂的加工历程，包括去除内含子的剪接反应(splicing)。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

46. 原核生物中rRNA前体的加工 30S前体 甲基化作用 专一核酸外切酶 17S 25S tRNA 专一核酸外切酶 专一核酸外切酶 16S rRNA tRNA 23S rRNA 5S rRNA 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

47. 加工rRNA的酶是RNA酶Ⅲ。30S前体在体外能被RNA酶Ⅲ所切割而形成成熟的rRNA分子。16S和23S rRNAs的前体分别称为p16和p23，它们分别比16S和23S略长一些。在初级转录本中，由于p16、p23的两端的碱基都是互补的，它们分别形成很大的发夹。其特征是发夹顶的环非常大，分别为1600个核苷酸和2900个核苷酸。

48. 真核生物中rRNA前体的加工 哺乳动物的初级转录本是一条45S RNA链。含有18S、5.8S和28S rRNAs。它含有约110个甲基，这是在转录过程中或刚刚转录好时加工上去的。几乎所有甲基均连接在核糖残基上，在被加工成熟的rRNAs中，这些甲基全部被保存。在成熟的18S rRNA上有约39个原来的甲基，只有4个是后来在细胞浆中加上去的。而在28S rRNA中有约74个甲基，全部是原来的。有人认为甲基的存在是初级转录本转变成熟的rRNA的标志。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

49. 成熟的途径可能不止一条，因为中间产物的长度在不同途径中是不一样的，然而最终产物都是一样的，其中两条途径(HeLa途径和L途径)切割的位置是[1] 18S基因的5'则，[2] 18S和5.8S基因之间的间隔区(spacer)，和[3] 5.8S和28S序列之间的间隔区(5.8S序列成为一个和28S rRNA通过碱基配对相结合的小RNA)。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

50. 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国