מאלפי הגנים קובץ מחקרים בביוטכנולוגיה

1. מאלפי הגניםקובץ מחקרים בביוטכנולוגיה עריכה ועיצוב מצגת – תמי צור 2004

2. מאמר 1 –פיתוח חיישן ביולוגי לאיתור חומרים הפוגעים בחומר התורשתי • העתיקו את כותרת המאמר במחברת. • מה לא ברור לכם בכותרת, ועל מה הייתם רוצים לקבל מידע נוסף? • ענו על שאלה זו במחברת. • עובד על פי המאמר: • Import bacterial SOS promotor: lux fusion for genotoxicity • מאת יעקב דוידוב, רחל חזן, דנה סמולסקי, טינה ואן-דיק, אמי וולמר, דוד אלסמור, רוברט לה-רוסה ושמשון בלקין מהמחלקה למיקרוביולוגיה סביבתית באוניברסיטה העברית.

3. מה לא ברור לכם בכותרת, ועל מה הייתם רוצים לקבל מידע נוסף? • מהו חיישן ביולוגי? • מה תפקידו? • כיצד החומרים פוגעים בחומר התורשתי?

4. מה לא ברור לכם בכותרת, ועל מה הייתם רוצים לקבל מידע נוסף? • (נכתב לאחר קריאת המאמר) • מהו חיישן ביולוגי? • אלו חומרים פוגעים בחומר התורשתי ? • כיצד מאתרים חומרים אשר פוגעים בחומר התורשתי? • מדוע צריך לפתח חיישן ביולוגי?

5. מה לא ברור לכם בכותרת, ועל מה הייתם רוצים לקבל מידע נוסף? • מה זה חיישן ביולוגי? • מה הם החומרים הפוגעים בחומר התורשתי? • מי פיתח את החיישן הביולוגי? • כיצד מאתר החיישן הביולוגי את החומרים האמורים? • כיצד מפתחים את החיישן הביולוגי?

6. מה לא ברור לכם בכותרת, ועל מה הייתם רוצים לקבל מידע נוסף? • מה הכוונה בחיישן ביולוגי? • האם מדובר בצמח או בע"ח? • האם החיישן הוא חד פעמי או רב פעמי? • איך החומרים פוגעים בחומר התורשתי? • כיצד מפתחים את החיישן? • כיצד החיישן פועל?

7. דיון לאחר קריאת התמצית והמבוא של המאמר • האם נתקלתם בקריאה במושגים שאינם ברורים לכם? • בואו נבדוק על אילו מהשאלות שהעלתם קודם ניתן לקבל תשובה כבר עכשיו, לאחר קריאת המבוא. • מה הייתה מטרת החוקר? כיצד הייתם מציעים לו לבדוק את השערתו?

8. משימות למבוא • למה הכוונה "שיטות זיהוי כימיות"? • השוו בין שתי השיטות (יתרונות וחסרונות): "שיטות זיהוי כימיות" לבין "מבחני רעילות ביולוגיים". הציעו דוגמא לחיישן כימי ולחיישן ביולוגי.

9. חיידק הפועל כחיישן ביולוגי איזור הבקרה מופעל על ידי חומר X וגורם לביטויו של הגן המדווח

10. במחקר זה... • במקום לחבר את הגן המדווח לאזור בקרה, המופעל בנוכחות חומר ספציפי • מחברים לאזור בקרה של מערכת המופעלת בעקבות נזק לחומר התורשתי. • בתא יש מספר מערכות שתפקידן לתקן נזקלחומר התורשתי. • מערכות אלו לא מגיבות לרעילות עצמה, אלא לנזק שגורמים חומרים כימיים ל – DNA • חומרים אלה נקראים גנוטוקסיים

11. בסדרת הניסויים שלהלן... • אזור הבקרה של מערכת SOS המופעלת בחיידקים בעקבות סכנה לנזק ל – DNA, לאופרון הגורם להארה. • בתא נורמלי – המערכת מופעלת – קרינת רקע קבועה • תאים מתים אינם מאירים • תאים שנפגעו – ההארה נחלשת • המערכת מאותתת – אורות גבוהים ואורות נמוכים מקרינת הרקע

12. מטרת המחקר הנוכחי: • אפיון הביצועים של החיישן הביולוגי בתנאים שונים: בנוכחות מגוון חומרים גנוטוקסים, בתמיסה בעלת הרכב בלתי מוגדר (מי שפכים) וכאשר החיידקים מקובעים במצע מוצק למחצה (ג'ל) לזמן ממושך. • שיפור רגישות המערכת על ידי שימוש בזנים שונים של חיידקים כחיישנים ביולוגיים.

13. שיטות וחומרים • בניית הגן המהונדס SOS-lux • בחירת אזור בקרה לגן המהונדס. • מערכת SOS היא מערכת תיקון אנזימתית, המופעלת בתא החיידק, כתוצאה מופעלת שברים או שינויים כימיים ב DNA. אנזימים השייכים למערכת ה – SOS מעורבים בתיקון ה DNA. • הפעלה של המערכת יכולה להעיד על מידת הגנוטוקסיות של חומרים כימיים שונים, וכן על השפעתה של קרינה רדיואקטיבית. • בחירת גן מדווח • בוחרים את אזור הבקרה של מערכת ה – SOS לאופרון בשם lux, שמקורו בחיידק הזוהר v.fischheri (5 גנים) • הגנים מקודדים לאנזים לוציפראז ולסובסטרט שלו. כשלוציפרז מפרק את הסובסטרט שלו נפלט אור בתהליך הדורש אנרגיה. • החיבור בין אזור הבקרה של מערכת SOS לאופרון lux מאפשר לראות מתי מופעלת בחיידק המערכת לתיקון נזקים ב – DNA, ללא צורך להוסיף חומרים מבחוץ.

14. חיידק הפועל כחיישן ביולוגי באמצעות מערכת SOS-lux. חומר גנוטוקסי גורם נזק ל – DNA, ובכך מפעיל את אזור הבקרה של מערכת ה – SOS. אזור הבקרה משרה ביטוי של אופרון ה – lux הגורם להארה. • ככל שיש בדגימה יותר חומר גנוטוקסי, אזורי בקרה יופעלו יותר, האנזים לוציפראז והסובסטרט שלו יסונטזו יותר והארת החיידקים תגבר. • מידת הרעילות של החומר הנבדק נקבעת על סמך העלייה בעוצמת ההארה. • מידת ההארה חושבה על פי היחס בין ההארה של החיידקים שנחשפו לחומרים גנוטוקסיים, לעומתה הארת הרקע של החיידקים בדגימת הביקורת, שלא נחשפו לחומרים אלו.

15. זני החיידקים • זן SOS-lux • זן SOS-lux tolC- זן זה דומה לזן הראשון מלבד העובדה שהוא נושא מוטציה בגן tolC. בזן המקורי תוצר הגן tolC הוא חלבון קטן, שנמצא בקרום התא ומשמש כתעלה לסילוק חומרים בעלי מולקולה גדולה והידרופובית מתוך התא. בהעדרו של החלבון כמו בזן המוטנטי tolC-נפגמת יכולתו של החיידק לסלק מתוך התא חומרים זרים שחדרו אליו והעשויים לגרום נזק .

16. תנאי הניסוי • לפני הניסוי גודלו החיידקים בטמפ' של 26oc במצע עשיר. • כל הניסויים בוצעו על שתי דגימות במקביל • שתי חזרות על כל ניסוי. • אחסנה בקרור ב 4oc • לפני המדידה גודלו החיידקים במשך הלילה בטמפ' של 26oc .

17. תגובת ההארה של החיידקים נמדדה בנוכחות חומרים, שהוכחו כגורמי נזק ל – DNA: • מיטומיצין C משנה את מבנה ה – DNA ע"י יצירת קשרים נוספים בתוך הגדיל ובין הגדילים, בכך הוא מונע את התעתוק וההכפלה של החומר התורשתי. • מי חמצן H2O2 שהוא חומר הידרופילי. יכול לגרום לאיבוד בסיסים ב DNA • שני החומרים מסרטנים.

18. בניסוי המתואר בגרף 4 נעשה שימוש ב – 20 דגימות של שפכים ממפעלי תעשיה כימית לפני ואחרי טיהור, שנאספו במשך 10 ימים עוקבים בחודשים פברואר ומרץ 1994. • טיהור השפכים נעשה בדרך ביולוגית (תרבית חיידקים הניזונים מהחומרים האורגניים בשפכים) • כל הדגימות דוללו פי 10 לפני הניסוי. • הניסוי בוצע בטמפ' 26oc

19. תוצאות • משימה קבוצתית - • כל קבוצה מטפלת בגרף שונה: • על הקבוצה להסביר בפני הכתה בליווי שקופית/שקף • שאלות: • מה הייתה שאלת החוקרים? • באיזו שיטה הם השתמשו כדי לענות על השאלה

20. גרף 1: ההארה של החיידקים בתגובה לריכוזים שונים של מיטומיצין C ומי חמצן

21. קבוצה 1: בר, כרמל ונטלי תגובת ההארה של חיידקים מהונדסים לחומרים גנוטוקסיים בריכוזים שונים • בגרף זה נבדקה תגובת ההארה של חיידקים מהונדסים לחומרים גנוטוקסים בריכוזים שונים. • לחיידקים ישנה הארת רקע ללא קשר לחומרים הגנוטוקסים המוחדרים להם במהלך הניסוי, ולכן העקומים מתחילים מנקודה 1. • תגובת ההארה נמדדה בנוכחות חומרים גורמי נזק לDNA: מיטומיצין C , ומי חמצן. • בגרף מתבטא שרגישות החיישן הביולוגי למיטומיצין C גבוהה יותר מזו של מי החמצן. למיטומיצין C סף זיהוי נמוך יותר, ולכן הוא מתחיל לזהור בריכוז נמוך ממי החמצן. • ההארה גוברת ביחס לעליית ריכוז החומרים הגנוטוקסים, עד הגעה לנקודת שיא. • לאחר רמת השיא, חיידקים רבים שנחשפו לריכוזים גבוהים של חומרים גנוטוקסים, מתו או שתפקודם נפגע, ולכן החלו במגמת ירידה בהארה- במיטומיצין C, ובמי החמצן גם יחד.

22. קבוצה 2: דורון, ארי וירון ניתוח גרף 1: ההארה של החיידקים בתגובה לחומרים מיטומיצין C ומי חמצן • ככל שיש ריכוז חומרים גנוטוקסיים (מיטומיצין C ומי חמצן) גבוה יותר כך החיידקים יגיבו יותר. • תגובת החיידקים מתבטאת בהארה. • החיידקים מגיבים למיטומיצין C בריכוז נמוך. ככל שהריכוז יותר גבוה כך ההארה חזקה יותר. לאחר נקודת השיא של ההארה מתחילה דעיכה בהארה. • החיידקים מגיבים למי חמצן הרבה פחות מאשר הם מגיבים למיטומיצין C (בריכוז יותר גבוה). לאחר נקודת שיא הם דועכת ההארה במהירות גבוהה.

23. גרף 1 סיכום מתומצת • מהו הקשר בין ריכוז החומר הגנוטוקסי לבין רמת ההארה? • איך בודקים את ההארה – מפיקים בעזרת הלוציפראז. • לתשומת לב! הערכים בציר Y עולים פי 10 (לוגריתמי) • הארה יחסית – הם בדקו את ההארה יחסית לרקע • 1 = רקע. • כאשר החיידקים מתים אין הארה (קטן מ – 1) • החיישן מאותת גם באורות חזקים. • כשעולה הריכוז עולה ההארה עד גבול מסויים ואח"כ החיידקים מתים. • הרגישות טובה יותר למיטומיצין מאשר למי החמצן.

24. _ + גרף 2: ההארה של הזנים tolC-וtolC+ בתגובה לריכוזים שונים של מיטומיצין C ומי חמצן

25. קבוצה 3: דניאל, דור וראם עיבוד התוצאות לגרף 2 • שאלת החוקרים: באיזה מידה קיים קשר בין ריכוז החומר הגנוטוקסי שונים (מי חמצן, מיטומיצין C) ובין ההארה של חיידקים בעלי גן tolc+ או tolc-? • החוקרים השתמשו במערכת הבקרה של החיידק הפועל כחיישן ביולוגי הגורמת להארה במקרה של נזק ל-DNA. • בגן המוטנטי tolc-נפגמת יכולתו של החיידק לסלק מתוך התא חומרים זרים שחדרו אליו • ניתן לראות כבר מתחילת הניסוי כי ההארה היחסית מתחילה ב-1- הארת רקע. • השימוש בגן המוטנטי (tolc-) הגביר את רגישות החיידק למיטומיצין C אך לא למי חמצן. • ניתן לראות כי החיידקים רגישים פחות למי החמצן מפני שהוא הידרופילי.

26. גרף 2 - סיכום מתומצת • בגרף זה מופיע חיידק חדש tolC- • אין לו מנגנון לסילוק רעלים מהתא. • ל tolC+יש מנגנון לסילוק רעלים מתעלות בקרום התא • אםtolC-לא מסלק את החומרים התא רגיש יותר למיטומיצין C • התעלות הן ספציפיות לחומרים הידרופוביים . • מיטומיצין הוא חומר הידרופובי • H2O2 הוא חומר הידרופילי.

27. גרף 3: ההארה וזמן תגובה של זן SOS-luxtolC-בנוכחות מיטומיצין C בריכוז 100 מיקרוגרם לליטר, כפונקציה של מספר ימי אחסנה בטמפ' של 4oc

28. קבוצה 5: שיר סתיו ואור תשובות: שאלת החוקרים הייתה: באיזו מידה קיים קשר בין זמן האחסנה בנוכחות מיטומיצין C לבין זמן התגובה וכמות ההארה היחסית? השיטות בהם השתמשו החוקרים: אחסנת חיידקים מזן SOS-lux tolC- בנוכחות מיטומיצין C בריכוז 100 מיקרוגרם לליטר. החיידקים אוחסנו בטמפ' של 4 מעלות צלזיוס ונמדדה כמות הזמן עד שהופיעה ההארה, וכן כמות ההארה היחסית והנתונים הוצגו בגרף. הסבר הגרף ומסקנות: ככל שהחיידקים אוחסנו במשך זמן רב יותר בקרבת המיטומיצין C כך מספר הדקות שעבר עד להופעת תגובה גדל וכן כמות ההארה היחסית קטנה. ניתן להסיק מכך כי החיידקים "הסתגלו" לחומר.

29. קבוצה 6: עומרי, שרית ואריק תשובות: שאלת החוקרים הייתה מה ההשפעה של קירור החיידקים על מנת לשמור על חיי מדף ארוכים, בכדי להפוך את החיידקים למוצר שיווקי. החוקרים לקחו מספר קבוצות של חיידקים ושמו כל קבוצה למספר ימים שונה בטמפרטורה של 0c4, לאחר מכן הוסיפו לכל קבוצה את החומר מיטומיצין C ובדקו את הזמן שלוקח לכל קבוצה להגיב לחומר הזה, ובדקו את עוצמת ההארה שלהם. התוצאות: ככל שהחיידקים היו יותר זמן בקירור זמן התגובה של החיידקים לחומר מיטומיצין C עלה, ועוצמת ההארה שלהם ירדה,ישנו קשר הפוך בין זמן התגובה לעוצמת ההארה

30. גרף 3 - סיכום מתומצת • מהם חיי המדף של החיישן? • ככל שהזמן עובר ההארה היחסית יורדת. • זמן תגובה הולך ועולה. • שני הדברים שלא היינו רוצים שיקרו קורים. • זה השלב שבו נמצאים בפרויקט.

31. גרף 4: תגובת ההארה בעקבות חשיפה לשפכים תעשייתיים ולשפכים מטוהרים. הדגימות דוללו פי עשר לפני הניסוי.

32. קבוצה 7: מיכל ומתן ב. תגובת ההארה בעקבות חשיפה לשפכים תעשייתיים ולשפכים מטוהרים. הדגימות דוללו פי עשר לפני הניסוי. ת:באיזו מידה מושפעת ההארה מחשיפה לשפכים תעשייתיים ולשפכים מטוהרים ? ת: החוקרים פיתחו חיישן ביולוגי על בסיס חיידק שהונדס גנטית המסוגל לבדוק ולזהות גנוטוקסים שונים אשר פוגעים בחומר התורשתי של החיידק. זה קורה כיוון שהחיידק הונדס בקטע הDNA שלו שמדווח על נזק (sos) . החוקרים חיברו את אזור הבקרה של ה sos, המופעלת בחיידקים בעקבות סכנה לנזק, במקרה הזה רעלים במי שפכים.

33. קבוצה 8: תום ברק ואדם תגובת ההארה בעקבות חשיפה לשפכים תעשייתיים ולשפכים מטוהרים שאלת החוקרים הייתה: באיזו מידה משפיע הטיהור הביולוגי של שפכים תעשייתיים על יכולת הניטור של החיידקים? על מנת לענות על שאלה זו, עקבו החוקרים אחר מידת ההארה היחסית של חיידקים בשפכים תעשייתיים ובשפכים מטוהרים לאורך זמן של שבועיים, והשוו בין התוצאות. מהתוצאות ניכר היה כי מידת ההארה של החיידקים בשפכים התעשייתיים הייתה גבוהה ממידת ההארה של החיידקים בשפכים המטוהרים לכל אורך הניסוי. תוצאה זו מאששת את ההשערה, ונובעת מכך שבשפכים הלא-מטוהרים ריכוז גבוהה יותר של חומרים גנוטוקסיים.

34. גרף - סיכום מתומצת • תגובת ההארה בעקבות חשיפה לשפכים תעשייתיים ולשפכים מטוהים. • בגרף רואים שבשפכים תעשייתיים מעורבבים יש השפעה על ה – DNA. • החיישן הביולוגי יכול לזהות גם בתערובת אם יש פגיעה ב – DNA.

35. חשוב לזכור! • מה שפוגע בחיידק לאוו דווקא יפגע בנו. • ולהפך מה שפוגע באדם יזוהה על ידי החיידק. • צריך להפעיל סוללה של חיישנים כימיים וביולוגיים כד שהאדם ישפוט אם יוכל לשתות מים אלו.