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Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele. muva kempten Dr. Monika Knödlseder. Beispiele: Bifidobakterien Laktobazillen Cronobacter PCR. Bifidobakterien. Bifidobakterien. werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt

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Presentation Transcript
leistungspotentiale und grenzen mikrobiologischer methoden dargestellt anhand konkreter beispiele

Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele

muva kempten

Dr. Monika Knödlseder

slide2
Beispiele:
    • Bifidobakterien
    • Laktobazillen
    • Cronobacter
    • PCR
bifidobakterien
Bifidobakterien
  • werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt
  • keine „offizielle“ spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien
  • ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)
bifidobakterien1
Bifidobakterien
  • ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)
    • Für Milchprodukte
    • IDF – Ringversuch 2006 21 Labore (Europa, Japan und Neuseeland)
    • Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP)
      • Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen)
      • Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert
bifidobakterien2
Bifidobakterien

Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

Probe: Milchprodukte (z.B. Milchpulver, Starterkultur)

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung Gussplattenverfahren

12 - 15 ml TOS-MUP-Agar

Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:

Koloniemorphologie:

Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt

Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur

Evtl. F6PPK Assay

Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl:

  • Alle Platten mit ≤ 300 Gesamt-Kolonien
  • Bifidobakterienstämme können unterschiedliche Koloniegrößen und Koloniemorphologien auf dem Nährmedium zeigen
bifidobakterien3
Bifidobakterien

Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie

TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.

bifidobakterien4
Bifidobakterien

Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich

  • Methode 1
  • muva-Methode
  • Nachweis mit RCM-Agar
  • Spatelverfahren
  • anaerob
  • Methode 2
  • ISO-Vorschlag
  • Nachweis mit TOS- MUP- Agar
  • Gussplattenverfahren
  • anaerob
bifidobakterien5
Bifidobakterien

Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen

hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar

bifidobakterien6
Bifidobakterien

Zusammenfassung

ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:

bifidobakterien7
Bifidobakterien
  • Nachteil:
    • Bezug des Nährbodens in Japan
    • kein europäischer Anbieter (derzeit)
laktobazillen
Laktobazillen

Nachweis von Laktobazillen –

Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung - Spatelverfahren auf MRS - Agar pH 5,4

Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

Bestätigung und Zählen der Kolonien:

- Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie

-> KOH: negativ

-> Katalase: negativ

- Zählen der Platten (10 bis < 300 Gesamt-Kolonien)

  • Identifizierung der Spezies:
  • ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux)
  • oder FTIR-Spektroskopie
laktobazillen1
Laktobazillen

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – „gleiche“ Ergebnisse

Maximale Abweichung: 23% 23% 25% 10% 28% 25%

Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Probe 1

Lb. delbrueckii Probe 2

Lb. delbrueckii Probe 3

Lb. delbrueckii Probe 4

laktobazillen2
Laktobazillen

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

laktobazillen3
Laktobazillen

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

Kultur

Lb. delbrueckii

Joghurtproben mit Kultur

Lb. delbrueckii

laktobazillen4
Laktobazillen

Zusammenfassung:

  • Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco-Agar
  • bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR-Identifizierungsergebnis
laktobazillen5
Laktobazillen

Zusammenfassung:

Aber:

  • in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl
  • bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies)
  • bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)
enterobacter sakazakii iso ts 22964 idf rm 210 2006
Enterobacter sakazakiiISO/TS 22964IDF/RM 210:2006

Probe:-milk and milk products (milk powder and powdered infant formula) and -environmental samples collected from milk powder or infant formula factories

Inkubation bei 37 ± 1 °Cfür 18 h ± 2 h

gepuffertes Peptonwasser

Inkubation bei 44 ± 0,5°C für 24 ± 2 h

Selektive Anreicherung in mLST/Vanvomycin Medium

Ausstrich der mLST/vancomycin Kultur auf den chromogenen Selektivnährboden

Inkubation bei 44 ± 1°C für 24 ± 2 h

Bestätigungstests

slide22

Prüfmittel

Bsp.: Inkubationstemperatur nicht eingehalten

Selektive Anreicherung bei 44 °C inkubiert

Selektive Anreicherung bei 46 °C inkubiert

cronobacter
Cronobacter
  • Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung
    • Optimierung des Verfahrens
    • Horizontales Verfahren
    • Derzeit in der Diskussion:
      • Inkubation der Selektivmedien 22-26 h bei 41,5 ± 1 °C
      • Austausch der Selektivmedien
        • Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST)
        • Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)
slide25

Hohe Spezifität

  • Hohe Sensitivität
  • Zeitgewinn gegenüber kulturellen Verfahren in der Mikrobiologie

Gesamtdauer mit Anreicherung 1-2 Tage gegenüber bis zu 10 Tagen für kulturelle Verfahren

  • Mit Multiplex - PCR mehrere Parameter gleichzeitig nachweisbar
  • Vielseitige Einsatzmöglichkeiten
    • Mikrobiologie
    • GMO
    • Tierartendifferenzierung
    • Pathologie……

Potential der

PCR

slide26
PCR / real – time PCR

Wie geht man mit positiven Befunden um?

Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?

slide27
PCR

Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts

  • Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG)

(2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind….

    • Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen
    • die Rückstellproben des Probenmaterials
    • die Isolate
      • während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren
      • der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.
kompetenz des labors
Kompetenz des Labors
  • Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen
  • Laborkompetenz: Bsp.
    • Ringversuche
    • Interne Kontrollen
    • Prüfmittelüberwachung
    • Schulung - Laborbegehungen

Qualitätssicherung im Labor

  • Mikrobiologisches Fachwissen
vielen dank f r ihre aufmerksamkeit

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

Unser Team:

Dr. Christine Bürk Dr. Ursula Hartmann

Marion Seidl Isolde Degle

Dr. Karlheinz Friedrich

Dr. Monika Knödlseder

slide31
5.3 Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar
  • 5.3.1 Composition
  • Tryptic digest of casein
  • Yeast extract
  • Sodium chloride (NaCl)
  • 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside
  • Sodium desoxycholate (C24H39NaO4)
  • Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3)
  • Sodium thiosulfate (Na2S2O3)
  • Agar
  • Water
  • Kein Crystal violet
slide32
5.2. Cronobacter screening broth (CSB)
  • 5.2.1 Base medium
  • Enzymatic digest of animal tissues
  • Meat extract
  • Sodium chloride (NaCl) (weniger)
  • Bromocresol purple
  • Sucrose (C12H22O11)
  • Water
  • 5.2.2. Vancomycin solution
bifidobakterien n hrmedien
Bifidobakterien –Nährmedien

Nachweis von Bifidobakterien: Nährmedienzusammensetzung

laktobazillen n hrmedien
Laktobazillen - Nährmedien

Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller

slide36
Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses:
  • Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien
  • Alle Kolonien werden gezählt
  • Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g
  • Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet
kompetenz des labors1
Kompetenz des Labors
  • Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden?
  • Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil?
  • Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)
staphylokokken enterotoxine set verordnung eg 2073 2005 anhang i
Staphylokokken-Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I
  • In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft →

Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs:

2.2.3. Käse aus Rohmilch2.2.4. Käse aus Milch, wärmebehandelt …..2.2.5. Frischkäse aus Milch … , wärmebehandelt ….2.2.7. Milch- und Molkepulver

Bei Grenzwertüberschreitung: koagulasepositive Staphylokokken > 105 KBE/g

Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g

nachweis von set problematik falschpositiver ergebnisse
Nachweis von SET- Problematik falschpositiver Ergebnisse
  • In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich:

es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren:

  • Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung
  • Thermonuklease-Nachweis(Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind)
  • Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil)

(aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)

slide40
Eingesetzte Volumen für die PCR
  • Von 5 μl bis 1 ml
  • BAX 5 μl
  • Roche 1 ml
  • EHEC 1 ml
verordnung zur durchf hrung von vorschriften des gemeinschaft lichen lebensmittel hygienerechts
Verordnung zur Durchführung von Vorschriftendes gemeinschaft-lichen Lebensmittel-hygienerechts
  • Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern
  • § 3: Betriebseigene Kontrollen
  • (1) Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 ...... oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen
    • Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.
bifidobakterien methoden vergleich
Bifidobakterien – Methoden-vergleich

Nachweis von Bifidobakterien: Methodenvergleich detailliert

Bifidobakterien

Laktob.

bifidobakterien vergleichsunter suchungen
Bifidobakterien – Vergleichsunter-suchungen

Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen

hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar

Bei gut 80% der Proben lag die Abweichung der ermittelten Keimzahlwerte unter 40%

laktobazillen nachweis
Laktobazillen - Nachweis

Nachweis von Laktobazillen –

Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf MRS-Agar pH 5,4 ansetzen

Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:
  • - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie: sporenlose Stäbchen
  • -> KOH: negativ
  • -> Katalase: negativ
  • - Zählen der Platten mit i.d.R. 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien
  • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und
  • Angabe als KbE /ml oder KbE/g
  • Identifizierung der Spezies:
  • ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux)
  • oder FTIR-Spektroskopie
grenzen der mikrobiologie
Grenzen der Mikrobiologie:
  • fehlende Nachweismethode
  • trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden
  • unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen
  • unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)
bifidobakterien nachweis

Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf RCM-Agar pH 5,9 ansetzen

Inkubation: 72 ± 2 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

(bei Proben mit einem hohen Anteil Lactobacillus (para)casei: Inkubation bei 42°C)

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:

Koloniemorphologie:

porzellanweiße, leicht erhabene Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm

Bestätigungstests:

    • Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv)
    • Katalase-Test: negativ

Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl:

- Alle Platten mit 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien

  • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g
Bifidobakterien- Nachweis

Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar:

bifidobakterien nachweis1

Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung im Gussplattenverfahren

mit ca. 15 ml TOS-MUP-Agar (ca. 48°C, hitzesensibel!) ansetzen

Inkubation: 72 ± 4 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:

Koloniemorphologie:

Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt

Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur (ggf. KOH und Katalase bei unklarer Mikroskopie)

    • Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv)
    • Katalase-Test: negativ

Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl:

- Alle Platten mit 0 bis < 300 Gesamt-Kolonien

  • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g
Bifidobakterien- Nachweis

Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

leistungs potentiale
Leistungs-potentiale

Moderne Methoden :

  • PCR:
    • Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage
    • Listerienanalyse ca. 2 Tage
    • STEC ca. 2 Tage
    • Cronobacter ca. 2 Tage
  • FTIR Analyse:

Absorption aller Zellbestandteile

→ Chemische Zusammensetzung des

Keimes wird „dargestellt“

→ definierte Wellenlängenbereiche werden für einen „Fingerabdruck“ des Keims ausgewertet

bifidobakterien zusammen fassung
Bifidobakterien – Zusammen-fassung

Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung

ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:

probenahme planung
Probenahme-planung
  • Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele:
    • Der zu untersuchende Probenteil: Käserinde bei der Untersuchung auf Listeria monocytogenes
    • Repräsentative Probenahme / Stichproben entsprechend Anlage 1 der Verordnung (EG) 2073/2005
    • „kritische“ Anlagenteile unter Berücksichtigung möglicher Biofilm- bzw. Nischenbildung
  • Festlegen relevanter Untersuchungsparameter, Beispiel:
    • Schmierlösung und Gully-Inhalte auf Listerien
bifidobakterien kolonie morphologie
Bifidobakterien- Kolonie-morphologie

Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie

RCM-Agar, 37°C, 72 Std.

TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.