Ενζυμική Βιοτεχνολογία

1. Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων

2. Κατάταξη Ενζύμων με βάση τον όγκο παραγωγής και αγοράς Μεγάλου όγκου ή βιομηχανικάένζυμα (industrial enzymes) Μικρού όγκου ή υψηλής προστιθέμενης αξίαςένζυμα (high added value enzymes) • Εξωκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) • Χαμηλή καθαρότητα • Μεγάλες ποσότητες παραγωγής • Φθηνό κόστος παραγωγής και αγοράς • Ενδοκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) • Υψηλή καθαρότητα • Μικρές ποσότητες παραγωγής • Ακριβό κόστος παραγωγής και αγοράς

3. Προέλευση Ενζύμων • Ζωικής Προέλευσης • Λιπάση (πάγκρεας χοίρου, βιομηχανία καλλυντικών) • Θρυψίνη (πάγκρεας μόσχου και χοίρου, επεξεργασία δέρματος) • Αφυδρογονάσες (καρδιακό ή σκελετικό μυ θηλαστικών, διαγνωστική και αναλυτική επιστήμη) • Φυτικής Προέλευσης • Παπαΐνη (Carica Papaya, ζυθοποιία) • Οξαλοξική οξειδάση (ρίζες κριθαριού, προσδιορισμός οξαλοξικού οξέος) • Υπεροξειδάση (ραφανίδα, ένζυμο δείκτης ενζυμικών αντιδράσεων) • Μικροβιακής Προέλευσης • Περιοριστικά ένζυμα (διάφοροι μικροοργανισμοί, μοριακή βιολογία)

4. Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Τι είναι; • Συστήματα παραγωγής πρωτεϊνών ως αποτέλεσμα έκφρασης ανασυνδυασμένων γονιδίων που κωδικοποιούν τα επιθυμητά πολυπεπτίδια • Πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης διατηρούν και εκφράζουν τα επιθυμητά ανασυνδυασμένα γονίδια στα συστήματα έκφρασης • Συστήματα έκφρασης: προκαρυωτικοί και ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί, κυτταροκαλλιέργειες ανώτερων οργανισμών, φυτά, ζώα, cell-free συστήματα έκφρασης...

5. Ετερόλογη Έκφραση: Τι χρειαζόμαστε;

6. Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Cell-free Insect Yeast Bacterial Transgenic animals Transgenic plants Mammalian

7. Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Κύριες εφαρμογές: • Παραγωγή πρωτεϊνών που συναντώνται σε χαμηλές ποσότητες στις φυσικές πηγές, για άμεση απομόνωση και λειτουργική-δομική τους ανάλυση. • Βιομηχανική παραγωγή πρωτεϊνών για βιοφαρμακευτική χρήση. • Χαρακτηρισμό πρωτεϊνών που έχουν ανιχνευθεί μέσω τεχνικών reverse genetics. • Δομική και λειτουργική ανάλυση πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας τεχνικές μεταλλαξογέννεσης • Παραγωγή πρωτεϊνών με νέες ιδιότητες εφαρμόζοντας τεχνικές πρωτεϊνικής μηχανικής

8. Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans Aspergilus niger, Aspergillus oryzae,Pishia pastoris……… Γενετικά ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί Τεχνική κλωνοποίησης ανασυνδυασμένου DΝΑ Επιλογή πλασμιδιακού φορέα έκφρασης Επαγωγή υπερέκφρασης Αντίδραση συγκόλλησης Μετασχηματισμός Κυττάρων έκφρασης PCR στο αντίστοιχο γένωμα

9. Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Escherichia coli: το πιο χρησιμοποιημένο βακτήριο για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών • Γρήγορο, φθηνό, εύκολο (όταν δουλεύει) • Εύκολη κλωνοποίηση και γενετική τροποποίηση • Μικρός κόστος καλλιέργειας • Γρήγορη ανάπτυξη και έκφραση

10. Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Βασικά βήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών: • Απομόνωση και πολλαπλασιασμός του γονιδίου στόχου (PCR) • Μεταφορά του γονιδίου σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης (pET) • Μετασχηματισμός E. coliκυτταρικής σειράς έκφρασης (Bl21DE3) • Μικρής κλίμακας υπερέκφραση • Έλεγχος έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (ενζυμική δοκιμή, western blot) • Μεγάλης κλίμακας υπερέκφραση • Απομόνωση πρωτεΐνης (Χρωματογραφία)

11. Παραγωγή ανθρώπινων πρωτεϊνών μέσω γενετικά ανασυνδυασμένων μικροοργανισμών

12. Οργανισμός (Πηγή πρωτεΐνης) Ανιούσα Επεξεργασία (Έκφραση πρωτεΐνης) Κατιούσα Επεξεργασία (Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης) Καθαρό Πρωτεϊνικό Παρασκεύασμα

13. Κατιούσα Επεξεργασία Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμός Στερεών και Υγρών Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Τελικό Στάδιο Μορφοποίηση Προϊόντος

14. Ίζημα : Ενδοκυτταρικές, μεβρανικές πρωτεΐνες Φυγοκέντρηση Υπερκείμενο : Εξωκυτταρικές πρωτεΐνες Αρχικό ΣτάδιοΔιαχωρισμού Στερεών και Υγρών Φυγοκέντρηση συνεχούς ροής Φυγοκέντρηση σε ειδικά δοχεία

15. Μικροδιήθηση : 0,005-2μm Διήθηση Υπερδιήθηση: 0,002-0.2μm Αρχικό ΣτάδιοΔιαχωρισμού Στερεών και Υγρών

16. Διάρρηξη Κυττάρων • Μη Μηχανικές ΤεχνικέςΩσμωτικό σοκΑλκαλική λύση (pH 11-12,5)Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (Tween, Triton)Οργανικοί διαλύτες (τολουόλιο, ακετόνη)Ενζυμική λύση (λυσοζύμη) • Μηχανικές ΤεχνικέςΕφαρμογή υπερήχωνΕφαρμογή υψηλής πίεσης Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους

17. Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Εφαρμογή υπερήχων Sonicator

18. Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Εφαρμογή υψηλής πίεσης French Press Cell Press

19. Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους Glass beads

20. Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Κατακρήμνιση με οργανικούς διαλύτες Κατακρήμνιση σε υδατικά διφασικά συστήματα Θερμική Επεξεργασία Κατακρήμνιση με άλατα Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων (πολυαιθυλενιμίδιο, θειική στρεπτομυκίνη, βρωμιούχο κετυλο τριμεθυλαμμώνιο, πρωταμίνη, δεοξυριβονουκλεάση)

21. Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Χρωματογραφία Διαπερατότητας(gel filtration)http://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής(Ion exchange chromatography) http://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8 Χρωματογραφία Συγγένειας(Affinity chromatography) http://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y Χρωματογραφία Υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων(Hydrophobic interaction) http://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y

22. Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Fast protein liquid chromatography FPLC

23. Τελικό ΣτάδιοΜορφοποίησης Προϊόντος • Απομάκρυνση μικρομοριακών ουσιών (υπερδιήθηση, χρωματογραφία διαπερατότητας) • Προσθήκη σταθεροποιητών ενζυμικής ενεργότητας (γλυκερόλη, άλατα, υπόστρωμα, αλβουμίνη…) • Ποιοτικός έλεγχος πρωτεϊνών(ανάλογα με τις προδιαγραφές χρήσεις)

24. Minotech • Παραγωγική μονάδα του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας απο το 1987 (πιστοποίηση IS0 9001:2008) • Απομόνωση πρωτεϊνών ετερόλογα εκφρασμένων σε βακτήρια. • Προϊόντα: • Restriction Enzymes• DNA Modifying Enzymes• Nucleic Acids and Markers• Cytokines• Specialty Enzymes• Antibodies• Reagents