Савичева Алевтина Михайловна

1. Целесообразность стандартизации лабораторных технологий в диагностике ИППП Савичева Алевтина Михайловна Научно – исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН Санкт-Петербург

2. Вопросы для врача - клинициста • Можете ли Вы доверять результату анализа, полученному в Вашей лаборатории? • Получите ли Вы тот же результат, если отправите свою пробу в другую лабораторию? Савичева А.М., 2008

3. Система качества лабораторной диагностикитерминология Обеспечение качества– полная процедура, гарантирующая, что заключительный результат, сообщаемый лабораторией, точен настолько, насколько это возможно. Включает в себя документацию, контроль образцов, описание стандартных процедур (технологии), использование самых надежных методов и верификация заключений. Контроль качества– это те меры, которые необходимы во время каждого исследования для обеспечения должной его работы. Включает в себя правильные температурные условия, контроли в составе набора и т.п. Таким образом, контроль качества указывает, что исследование выполнено правильно и получены достоверные результаты. Исследование качества– средство определения качества результатов. Обычно это система внешней оценки качества лабораторий. Управление качеством – система менеджмента качества в соответствии с международным стандартом ISO 15189

4. Контроль качества исследований должен быть включен в государственную программу • Первичные задачи • оценить качество лабораторной работы на общенациональной основе • предоставить гарантию потребителям (врачам и пациентам), что лабораторные результаты надежны • Вторичные задачи • идентифицировать общие ошибки и рекомендовать корректирующие меры • поощрять лаборатории, использующие стандартизированные процедуры, адекватные тесты и высококачественные реактивы • поощрять выполнение проверки качества и мер контроля в лабораториях • стимулировать информационный обмен и связь между лабораториями на национальном и/или международном уровне • предоставлять обновленную информацию о диагностике

5. Актуальность Отсутствие общепринятых стандартов назначения и проведения лабораторных исследований в рамках отдельных нозологических форм и на различных этапах оказания медицинской помощи приводит к повсеместному снижению качества выполняемых исследований, их многократному дублированию, выполнению излишних, не имеющих достаточного клинического обоснования исследований. Активные исследования и ряд открытий в области медицины за последние десятилетия пополнили лабораторную диагностику большим количеством новых методик. Спектр лабораторных исследований значительно расширился, предоставив врачу-клиницисту огромный выбор диагностических методик. Интенсификация работы в лаборатории поставила перед специалистами задачу усовершенствования мероприятий по контролю качества лабораторных исследований.

6. Структура ошибок M.Plebani, P.Carraro; Clin.Chem. (1997) 43:8, 1348-1351

7. Преаналитический этап лабораторного исследования Создание стандарта, регламентирующего организацию и контроль состояния преаналитического этапа лабораторного исследования • назначение врачом лабораторного анализа • получение клинического материала • транспортировка • поступление пробы в лабораторию До создания такого документа в каждом лечебно-профилактическом учреждении необходимо написать протокол преаналитического этапа. Врач клинической лабораторной диагностики отвечает за весь цикл лабораторного анализа, в том числе и за преаналитический этап

8. Факторы влияющие на качество микроскопической диагностики Получение образцов. Варьирующее качество: (данные, полученные во время обучения микроскопии): Толстые, поцарапанные стекла, старые микроскопы (лаборатории) В 30% образцов отсутствовали эпителиальные клетки; В 65% случаев мазки слишком толстые (ложечка Фолькмана) В 75% случаев материал из женской уретры не обнаружен (реакции лаборатории не отмечено) В 25% при постановке диагноза цервицита, не соблюдались основные критерии В 30% случаев диагноз цервицита поставлен на основании просмотра вагинального материала Domeika M., 2007

9. Факторы влияющие на качество диагностики Ведение пациентов На какие инфекции исследовать? На все 25? Какие тесты использовать? Всегда ли ПЦР лучше? Или просто хорошо звучит для пациента? Лечить или не лечить партнера? Domeika M., 2007

10. Аналитический этап Порядок проведения аналитического этапа подробно изложен в Приложении №1 к Приказу МЗ РФ № 45 “Положение об организации управления качеством клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения”.

11. Что такое «контроль качества» лабораторной диагностики • Контроль качества – это весь процесс, обеспечивающий выдачу качественного лабораторного продукта, т.е. результата лабораторного исследования • Контроль качества призван минимизировать любую вариабельность в результатах исследований, обусловленную различиями в: • Квалификации исследователей • Технологии получения клинического материала • Качестве реагентов и питательных сред • Используемой аппаратуры (своевременная поверка, техобслуживание и т.д.) • Методологии исследования

12. Система обеспечения контроля качества лабораторной диагностики Контроль качества лабораторной диагностики Обеспечение качества диагностики Оценка качества диагностики Валидация тестов (оценка нового теста путем сравнения с референс тестом) Внутренний контроль качества (использование отрицательного и положительного контролей реакции и др.) Систематический мониторинг работы оборудования Внутренний контроль качества (периодическое повторное тестирование зашифрованных клинических проб и др.) Внешний контроль качества (тестирование контрольных панелей, выпускаемых национальными и международными референс организациями)

13. Источники ошибок при микробиологических исследованиях

14. Микроскопические методы • Процедура окрашивания • Технология работы с микроскопом • Порядок проведения микроскопического исследования • Формулировка заключения • Возможные ошибки

15. Микроскопическое исследование материалов из цервикального канала и уретры, окрашенных МС Определение числа полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) при просмотре > 5 полей зрения при увеличении микроскопа х1000 Уретрит женщины: ≥ 10 ПМЯЛ в п/зрения Цервицит: ≥ 10 ПМЯЛ в поле зрения + наличие слизисто-гнойных выделений из цервикального канала Уретрит мужчины: ≥ 4 ПМЯЛ в п/зрения Савичева А.М., 2008

16. Результат исследования:

17. Культуральные методы • Технология приготовления питательных сред • Технология первичного выделения микроорганизма из клинического материала • Процедура идентификации • Контроль качества • Формулировка заключения

18. Количество положительных пробпри исследовании на N. gonorrhoeaeразными методами * - все результаты подтверждены секвенированием фрагмента гена 16S рРНК

19. Молекулярно-биологические методы • Существуют инструкции производителей • Всегда ли известны параметры чувствительности и специфичности? • Всегда ли известны пределы детекции?

20. Валидация тестов Любой коммерческий или “in-house” метод, а также любая модификация метода, перед внедрением в практику должны быть валидированы Цель валидации – убедиться, что новый метод/модификация работают, по меньшей мере, не хуже, чем уже существующий метод

21. Параметры тестов, оцениваемых в ходе валидации Чувствительность - способность метода правильно идентифицировать пробы, содержащие возбудителя (положительные референс методом)Специфичность - способность метода правильно идентифицировать пробы, не содержащие возбудителя (отрицательные референс методом) Прогностическая значимость отрицательных результатов - вероятность того, что пациент с отрицательным результатом теста действительно не инфицирован Прогностическая значимость положительных результатов - вероятность того, что пациент с положительным результатом теста действительно инфицирован Предел детекции – наименьшее количество возбудителя, которое выявляется данным методом Воспроизводимость - способность получать одинаковые результаты вне зависимости от лаборатории, оператора, серии среды/теста и т.д.

22. Референс-лаборатории Сhlamydia trachomatis- Швеция Neisseria gonorrhoeae- Норвегия Mycoplasma genitalium- Дания Trichomonas vaginalis- США

23. Референс-тесты • C. trachomatis: Roche COBAS Amplicor PCR • N. gonorrhoeae: real-time porA PCR (Hjelmevoll et al, 2006) • M. genitalium: real-time MgPa PCR (Jensen et al, 2004)

24. Несовпадающие результаты тестов на C. trachomatis(n=15)

25. Чувствительность тестов на C. trachomatis (%)

26. Специфичность тестов на C. trachomatis(%)

27. Предел детекции ПЦР тестов на C. trachomatis * определяли путем последовательных разведений коммерческого количественного стандарта (VIRCELL)

28. Несовпадающие результаты тестов на N. gonorrhoeae(n=3)

29. Чувствительность тестов на N. gonorrhoeae (%)

30. Специфичность тестов на N. gonorrhoeae(%)

31. Предел детекции ПЦР тестов на N. gonorrhoeae * определяли путем последовательных разведений коммерческого количественного стандарта (Advanced Biotechnologies)

32. Пациент Проба ДНК-технология Литех ЦНИИ эпидемиологии Референс тесты ПЦР-эф ПЦР-рв ПЦР-эф ПЦР-эф ПЦР-рв 1 2 3 86 Вагина + + + + + + + Моча – + – + + +/– + 95 Вагина + + + + + + + Моча – – – + + + + 129 Вагина – + – + + + + Моча – – – – + – – 167 Вагина – – – – – – – Моча – + – + + + + 280 Вагина – – – – – – – Моча – – – – – +/– + 327 Вагина + + – + + + + Моча – + – + + + + 383 Вагина – – – – – – – Моча – – – – – +/– – + Несовпадающие результаты тестирования проб от женщин (n=7)

33. Пациент Проба ДНК-технология Литех ЦНИИ эпидемиологии Референс тесты ПЦР-эф ПЦР-рв ПЦР-эф ПЦР-эф ПЦР-рв 1 2 3 34 Уретра – – – – – +/– – + Моча – – – – – – – 66 Уретра – + – – + – – Моча – – – – + +/– – – 248 Уретра + + + + + + + Моча – – – – + +/– – – 274 Уретра + + + + + + + Моча – – – – – – – 279 Уретра – – – – – – – Моча + + + + + + + 350 Уретра – – – – – – – Моча – – – – – +/– – + 402 Уретра – – – – – + + Моча – – – – – +/– – – 428 Уретра – – – – – – – Моча – + – + + + + + 450 Уретра + + + + + +/– – + Моча – + – + + + + Несовпадающие результаты тестирования проб от мужчин (n=9)

34. Микроорганизм Количество образцов Концентрация ДНК в конечном разведении штаммов M. genitalium M. genitalium G37 10 1 M. genitalium M30 8 6 M. genitalium M2288 10 3 M. genitalium M2300 10 1 M. genitalium M2341 10 35 M. genitalium M2321 10 140 M. pneumoniae 5 - M. hominis 1 - M. fermentans 1 - M. alvi 1 - M. arginini 1 - M. pirum 1 - M. primatum 1 - M. lipophilum 1 - M. amphoriforme 1 - M. faucium 1 - M. orale 1 - M. gallisepticum 1 - M. penetrans 1 - M. buccale 1 - Состав контрольной панели

35. ДНК-технология Литех ЦНИИ Эпидемиологии ПЦР-эф ПЦР-рв ПЦР-эф ПЦР-эф ПЦР-рв Чувствительность, % 89,7 (52/58) 100 79,3 (46/58) 98,3 (57/58) 100 Специфичность, % 100 88,9 (2 случая M. pneumoniae) 100 100 100 Предел детекции (копий на реакцию) 5-50 1-5 50-100 5-15 1-5 Аналитические характеристики ПЦР тестов, определенные с помощью контрольной панели

36. Сравнение тестов на T. vaginalis:несовпадающие результаты

37. Число случаев ингибирования

38. Постаналитический этап • формулирование заключения по результатам лабораторного исследования • доставка результатов анализа до клинициста • интерпретация лабораторных данных с учетом клинического состояния пациента Актуальная задача постаналитического этапа - подготовка клиницистов по вопросам лабораторной диагностики. Основой для оптимизации клинического использования лабораторных тестов должна быть система протоколов (национальных стандартов) ведения больных, определяющих, в частности, выбор наиболее информативных тестов, рациональную частоту повторения исследований и параметры интерпретации их результатов. Практическое применение лечащими врачами протоколов ведения больных в части лабораторной диагностики и мониторинга состояния больных должно осуществляться при сотрудничестве с лабораторными специалистами.

39. Формулировка ответов при диагностике гонореи Микроскопический метод обнаружены грамотрицательные внутриклеточные и/или внеклеточные диплококки, морфологически сходные с гонококками; грамотрицательные внутриклеточные и/или внеклеточные диплококки, морфологически сходные с гонококками, не обнаружены. Культуральный метод Neisseria gonorrhoeae выделены Neisseria gonorrhoeae не выделены ПЦР (другие МАНК) ДНК Neisseria gonorrhoeaeобнаружена ДНКNeisseria gonorrhoeae не обнаружена

40. Формулировка ответов при диагностике хламидийной инфекции ПЦР (другие МАНК) ДНК Chlamydia trachomatis обнаружена ДНК Chlamydia trachomatis не обнаружена Культуральный Chlamydia trachomatis выделены Chlamydia trachomatis не выделены Анализ повторить по причине цитопатического эффекта ПИФ Методом ПИФ Chlamydia trachomatis обнаружены Методом ПИФ Chlamydia trachomatis не обнаружены

41. Национальный стандарт • Национальный стандарт «Гонококковая инфекция» • Технологии выполнения простой медицинской процедуры • ?????? Алгоритм применения методов лабораторной диагностики …… инфекции (Протокол лабораторной диагностики)

42. Протоколы по лабораторной диагностике ИППП создавались в рамках международной ассоциации по репродуктивному здоровью и праву (руководитель Марюс Домейка, Швеция) при поддержке Шведского правительства и Восточно-Европейского комитета

43. Цель создания Протоколов по диагностике ИППП Стандартизация лабораторной диагностики ИППП в странах Восточной Европы, в частности, в Российской Федерации

44. Российская Федерация Республика Беларусь Украина Литва Латвия Эстония Болгария Венгрия Армения Азербайджан Грузия Киргизия Казахстан Таджикистан Узбекистан Страны

45. Алгоритм создания Протоколов по диагностике ИППП • Написание Протоколов по диагностике ИППП на русском языке • Перевод на английский язык • Чтение и правка Протоколов тремя!!! международными экспертами (по каждой инфекции) • Перевод на русский язык с английского исправленных Протоколов • Обсуждение Протоколов на двух языках с участием представителей всех стран и международных экспертов • Достижение консенсуса всех специалистов из всех стран • Представление Протоколов главным специалистам или министерствам каждой страны • Публикация Протоколов в каждой стране (в виде журнальной статьи или методических рекомендаций) • Утверждение Протоколов Министерством здравоохранения в качестве государственного стандарта (в ряде стран)

46. Созданные Протоколы • Протоколы лабораторной диагностики сифилиса • Протоколы лабораторной диагностики инфекций, вызванных Neisseria gonorrhoeae • Протоколы лабораторной диагностики инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis

47. Готовятся к обсуждению • Протоколы лабораторной диагностики бактериального вагиноза • Протоколы лабораторной диагностики инфекции, вызванной Trichomonas vaginalis • Протоколы лабораторной диагностикиурогенитального кандидоза • Протоколы лабораторной диагностики инфекций, вызванных Herpes simplex virus

48. Технологии выполнения простой медицинской услуги(21 технология) • Получение клинического материала (секрета простаты, секрета больших парауретральных и вестибулярных желез, из цервикального канала, из влагалища, из уретры, из прямой кишки, из конъюнктивы, из ротоглотки) • Микроскопическое исследование отделяемого женских половых органов, уретрального отделяемого и секрета простаты, отделяемого больших парауретральных и вестибулярных желез • Бактериологическое исследование отделяемого женских половых органов, уретры, прямой кишки, конъюнктивы (слезная жидкость) ротоглотки на гонококк (Neisseria gonorrhoeae) • Молекулярно-биологическое исследование отделяемого уретры, женских половых органов, секрета больших парауретральных и вестибулярных желез, конъюнктивы (слезная жидкость), секрета предстательной железы на гонококк (Neisseria gonorrhoeae)