Основы генетической инженерии растений

1. Основы генетической инженерии растений

2. Определение генетической инженерии Генетическая инженерия (современная биотехнология)– это технология получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства

3. "живой измененный организм" (генетически модифицированный, генетически измененный, трансгенный, генно-инженерный организм…)означает любой живой организм, обладающий новой комбинацией генетического материала, полученной благодаря использованию современной биотехнологии (Картахенский протокол по биобезопасности, ст.3)

4. Типичная трансгенная вставка

5. Этапы создания ГМО • Выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК) • Получение генетических конструкций путем манипуляций с нуклеиновыми кислотами in vitro • Создание векторных систем для переноса трансгенов в клетки • Перенос трансгенов в отдельные живые клетки, где они могут реплицироваться и передаваться дочерним клеткам • Получение из трансформированных клеток ГМО

6. Технология рекомбинантных ДНК Выделение ДНК и «разрезание» ее на отдельные фрагменты с помощью рестриктаз Клонирование генов Разделение фрагментов ДНК в пространстве с помощью электрофореза или клонирования в клетках E.coli Идентификация и модификация отдельных фрагментов ДНК или искусственный синтез генов, регуляторных элементов Соединение определенных фрагментов ДНК с целью построения генетических конструкций

7. Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми ферментами рестрикции и характер получаемых концов ДНК

8. Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей "липкие концы", то эти фрагменты соединятся между собой. Для воссоединения фосфодиэфирных связей между концами сшиваемых фрагментов ДНК необходим фермент ДНК-лигаза. Для целей генной инженерии большое значение имеет использование еще одного фермента – концевой трансферазы из тимуса теленка, который катализирует присоединение нуклеотидов к 3’-концам цепей ДНК. Благодаря этому из «тупого» конца ДНК несложно сделать «липкий».

9. Линкеры

10. Годом рождения генетической инженерии является 1972 г., когда появились первые публикации сотрудников лаборатории П.Берга (США). В них сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40 путем последовательного ее разрезания рестриктазойRI и сшивания ДНК лигазой [Mertz, Davis, 1972], а также возможности с помощью этих ферментов встраивать в такую молекулу гены других организмов: фага-λ и галактозный оперон бактерии E.coli[Jackson, Symons, Berg, 1972]. Первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК была получена в 1973 году. Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели "пришить" к плазмидеE.сoli фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химернаяплазмида могла успешно функционировать в клетках E.сoli, размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью человека [Cohen et al., 1973]

11. Создание рекомбинантнойплазмиды

12. Основные требования к векторуклонирования небольшой размер, поскольку эффективность клонирования чужеродной ДНК в E. сoliзначительно снижается при общей длине привнесенной рекомбинантнойплазмиды более 15 т.п.н.; наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; наличие одного или нескольких селективных генетических маркеров для идентификации трансформированных клеток (то есть включивших привнесенные гены). В качестве последних чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам.

13. Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования генов используют и другие векторные системы: фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели в плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н), плазмиды-космиды, содержащие cos-участок генома фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в них можно клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н), Искусственные хромосомы: на основе фага Р1 ( можно клонировать фрагменты ДНК длиной 100-300 т.п.н.), на основе F-плазмидыE. сoli (BAC – бактериальная искусственная хромосома, емкость 150-300 т.п.н.), дрожжей (YAC-дрожжевая искусственная хромосома, в ней можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК длиной порядка 800 т.п.н и более). В качестве клеток-хозяев для клонирования генов помимо E. сoliиспользуют также Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomycescerevisiae и др.

14. Выделение генов Искусственный синтез генов • На основании данных о последовательности аминокислот белка-продукта гена • С помощью ПЦР на основании данных о сиквенсе гена • С помощью RT-ПЦР на основе мРНК гена Выделение генов из смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК - с помощью электрофореза и in situ гибридизации ДНК с мечеными зондами - путем создания и анализа клонотек генов

15. Получение к ДНК с РНК-матрицыс помощью фермента обратной транскриптазы

16. Блоттинг по Саузерну

17. Строение генетических конструкций

18. Целевые гены. Трансгены и цисгены. Смысловые и антисмысловые конструкции Основные признаки: толерантность к гербицидам, устойчивость к насекомым-вредителям, устойчивость к вирусным болезням, система получения гетерозисных гибридов на основе мужской стерильности/восстановления фертильности, устойчивость к засухе, пригодность для производства биотоплива. удлинение сроков созревания и способность к длительному хранению, улучшенные качественные характеристики (состава жирных кислот растительного масла, крахмала, пониженное содержание никотина в листьях табака), улучшенные кормовые свойства,

19. Селективные гены Гены устойчивости к антибиотикам: npt II(neo, aphII ) неомицинфосфотрансферазыII из транспозонаTn5 E. coli гены устойчивости к гигромицину В, стрептомицину, хлорамфениколу и др. Гены толерантности к гербицидам: генфосфинотрицинN-ацетилтрансферазыbarот Streptomyceshygroscopicusи ген patот Streptomycesviridochromogenes Гены ферментов, катаболизирующих нетоксичные сахара маннозу, D-ксилозу, 2-деоксиглюкозу (man,xylA) гены, обеспечивающие ростовые преимущества или повышенную способность к морфогенезу трансформированных клеток (iptизопентилтрансферазы из Ti-плазмидыA. tumefaciens)

20. Репортерные гены Ген gus (или uidA) фермента β-глюкоронидазы изE. coli ген люциферазы (luc) из светлячков Photinuspyralis ген gfpзеленого флюоресцентного протеина (GFP- green fluorescent protein) из медузы Aequoreavictoria.

21. Получение ГМО без селективных генов Использование генетических конструкций без целевых генов Целевой ген толерантности к гербицидам может быть использован и в качестве селективного Котрансформация с последующим негативным отбором по селективным генам в расщепляющихся поколениях полученных трансформантов Удаления селективных генов из генома ГМО: использование генетических конструкций, содержащих последовательности транспозонов использовании сайт-специфическихрекомбиназ

22. Промоторы, используемые в генетической инженерии растений 1. Конститутивные промоторы: CaMV35S – вируса мозаики цветной капусты CMoVb – вируса мозаики норичника гена nosнопалинсинтазыAgrobacteriumtumefaciens гена ract1 актина риса гена ZmUbiубиквитина кукурузы 2. Тканеспецифические промоторы: PSsuAraот арабидопсиса (экспрессия в зеленых тканях) PTA 29 от табака (экспрессия в пыльниках) rbcS от арабидопсиса (светочувствительный)

23. Методы переноса трансгенов в клетки растений Прямой (биолистика) Непрямой (агробактериальная трансформация)

24. Приборы для биолистики

25. Агробактериальная трансформация с помощьюAgrobacteriumtumefaciens • Gram - • Dicots • Worldwide

26. Agrobacteriumtumefaciens • Опухоль возникает в результате необратимого переноса и включения определенного фрагмента (Т-ДНК, т.е. переносимой ДНК) плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки [Chiltonetal., 1977]. Причем гены, расположенные на Т-фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов — октопинов и нопалинов. Помимо этих соединений в клетках образуются в повышенных концентрациях различные фитогормоны, резко стимулирующие ростовые процессы, что приводит к образованию опухоли.

27. Строение T-области Ti-плазмидыAgrobacteriumtumefaciens

28. Агробактериальная трансформация

29. Коинтегративный и бинарный вектора LB RB Co-integrative Binary vector

30. Пример плазмидного бинарного вектора

31. Только трансформированные клетки способны делиться и регенерировать растения на питательной среде, содержащей селективный агент

32. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений Подтверждение вставки рекомбинантной ДНК: Саузерн-блоттинг ПЦР-детекция целевого гена или других элементов вставки Определение количества копий вставки, анализ наследования целевого гена при половом размножении Подтверждение экспрессии целевого гена: Нозерн-блоттинг ПЦР-детекциякДНК целевого гена Вестерн-блоттинг СиквенскДНК целевого гена Количественное определение степени экспрессии целевого гена

33. Методы детекции ГМС • Основанные на выявлении белков-продуктов трансгенов (ELISA-тест) • Основанные на детекции фрагментов ДНК, характерных для трансгенных вставок: • ПЦР + элетрофорез • ПЦР в реальном времени • ПЦР+детекция ДНК на биочипе

34. Схема лабораторного исследования: Выделение ДНК Идентификация растительной ДНК Идентификация регуляторных последовательностей, маркерных генов Идентификация трансформационного события Количественный анализ рекомбинантной ДНК

35. Специфичность ПЦР-анализа

36. Официально допущено к использованию 54 трансгенных событий (линий) кукурузы, в том числе 25 половых гибридов между различными ГМ-линиями . Из них 48 (89%) содержат 35S-промотор. Не содержат 35S-промотор линии GA21, MIR604, LY038, 3272, Event 98140 и гибрид MIR604×GA21. Линии GA21, MIR604 и 3272 содержат терминатор NOS. Официально допущено к использованию 17 трансгенных событий (линий) сои. Из них 11 содержат 35S-промотор.

37. Чувствительность метода ПЦР+электрофорез составляет 0,1%ГМО (35Sпромотор), что подтверждается анализом соответствующих референсных материалов: ОK413b 411b 413a410b 410a ПК Соя ПК Кук

38. Экспрессия трансгенов Транзиентная Стабильная Факторы, оказывающие влияние на стабильную экспрессию: Защитная реакция растений на чужеродный генетический материал Размер вставки и количество копий Перестройки ДНК вставки Состав вставки Строение трансгенов Строение промоторов Место встраивания в геном