マイクロアレイの臨床応用

1. マイクロアレイの臨床応用 東京大学大学院医学系研究科 健康科学・看護学専攻生物統計学 伊藤 陽一

2. がん臨床研究におけるマイクロアレイの利用 • 臨床検体(がん細胞)特有の問題 • 遺伝子発現測定のバラツキ • 遺伝子発現パターンによるがんの診断と予後予測(Ramaswamy, S. and Golub, T.R. 2002)

3. がん細胞検体の問題 • どの細胞を用いるのか(本質的に異質性が高い) • 特定の状態のがん細胞を用いる • がん細胞全体を用いる • 対照細胞を何にするのか(二蛍光標識法の場合) • 対象者の正常細胞 (Laser Capture Microdissection) • 培養した細胞株(正常細胞 or がん細胞)

4. (Simone, N.L. et.al. 1998)

5. 遺伝子発現測定のバラツキ • 遺伝子発現測定のバラツキの原因 • 検体における細胞組成のバラツキ • 検体の前処理段階におけるバラツキ • 非特異的クロスハイブリダイゼーション • アレイ間のバラツキ • 実験計画の段階からバラツキを減らす工夫が重要(Lee, M.T. et.al. 2000)(Kerr, M.K. and Churchill, G.A. 2001)

6. 遺伝子発現パターンによるがんの診断と予後予測遺伝子発現パターンによるがんの診断と予後予測 • 疾患分類研究 • 急性白血病分類(Golub, T.R. et.al. 1999) (Armstrong, S.A. et.al. 2002) • 予後予測研究 • びまん性大細胞型Bリンパ腫 (DLBCL)(Alizadeh, A.A. et.al. 2000)(Rosenwald, A. et.al. 2002)

7. 白血病とは • 造血系細胞が骨髄の中で腫瘍化すなわち白血病化した疾患 • 骨髄が白血病細胞により占拠され、正常造血機能が抑制 • 赤血球減少による貧血、白血球特に好中球減少による感染症、血小板減少による出血傾向

8. 白血病の病型分類 • 急性骨髄性白血病(acute myeloid leukemia; AML)FAB分類：M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7 • 急性リンパ性白血病 (acute lymphoblastic leukemia; ALL)FAB分類：L1, L2, L3 • 慢性骨髄性白血病 (chronic myeloid leukemia; CML) • 慢性リンパ性白血病群 • 慢性リンパ性白血病 (chronic lymphocytic leukemia; CLL) • 前リンパ球性白血病 (prelymphocytic leukemia; PLL) • 毛様細胞白血病 (hairly cell leukemia; HCL) • 大顆粒リンパ球性白血病 (large granular lymphoblastic leukemia; LGLL) • 慢性骨髄増殖性疾患群 (myeloproliferative disorders; MPD) • 真性赤血球増加症 (polycythemia vera; PV) • 本態性血小板血症 (essential thrombocythemia; ET) • 慢性好中球性白血病 (chronic neutrophilic leukemia; CNL) • 骨髄線維症 (myelofibrosis) • 成人T細胞白血病・リンパ腫 (adult T-cell leukemia/lymphoma; ATLL)

9. 急性白血病の鑑別診断 • 組織化学染色 • ペルオキシダーゼ染色(陽性：骨髄性、陰性：リンパ性) • エステラーゼ染色 • 細胞表面形質と細胞質内形質 • モノクロナール抗体 • 染色体と遺伝子異常

10. 急性白血病の鑑別診断法 Mixed Lineage Leukemiaの特徴 : t(4;11) etc. B-細胞系：CD19発現,CD10非発現 骨髄系 ：CD15発現 (Pui, C-H. et.al. 1991)

11. 疾患分類研究 • AMLとALLの分類(Golub. et.al. 1999) • 38検体(11 AML, 27 ALL) • 検証用34検体(14 AML, 20 ALL) • 6817遺伝子 • MLLとAML,ALLの分類(Armstrong. et.al. 2002) • 56検体(20 ALL, 17 MLL, 20 AML) • 12600遺伝子

12. Neighborhood Analysis “signal-to-noise”ratio (Golub. et.al. 1999)

13. Neighborhood Analysis (Golub. et.al. 1999)

14. 上位50遺伝子の遺伝子発現 (Golub. et.al. 1999)

15. 疾患分類研究 • AMLとALLの分類(Golub. et.al. 1999) • 38検体(11 AML, 27 ALL) • 検証用34検体(14 AML, 20 ALL) • 6817遺伝子 • MLLとAML,ALLの分類(Armstrong. et.al. 2002) • 56検体(20 ALL, 17 MLL, 20 AML) • 12600遺伝子

16. MLLとALL,AMLの分類 (Armstrong. et.al. 2002) 上位15遺伝子

17. 主成分分析 上位500遺伝子を用いた3次元プロット 8700遺伝子を用いた3次元プロット (Armstrong. et.al. 2002)

18. 疾患分類研究の問題点 • 既存の検査で分類可能な疾患を遺伝発現パターンで分類する必要性はあるのか • ｃDNAアレイを用いた場合の対照細胞は適切かどうか • 生物学的に解釈可能なのか • 結果の再現性はあるのか

19. 予後予測研究 • DLBCLのサブグループ化(Alizadeh. et.al. 2000) • 非ホジキンリンパ腫関連の12069遺伝子 • 二蛍光標識法(対照：種々のリンパ腫細胞株) • 正常細胞を含む96検体、128アレイ • DLBCLの予後予測(Rosenwald. et.al. 2002) • 240検体(モデル構築160,モデル検証80)

20. Gene expression signatures クラスター分析 (Alizadeh. et.al. 2000)

21. サブグループ化 (Alizadeh. et.al. 2000)

22. サブグループの予後 IPI≦2 v.s. IPI>2 IPI≦2 IPI Score : (The International Non-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project. 1993) (Alizadeh. et.al. 2000)

23. 予後予測研究 • DLBCLのサブグループ化(Alizadeh. et.al. 2000) • 非ホジキンリンパ腫関連の12069遺伝子 • 二蛍光標識法(対照：種々のリンパ腫細胞株) • 正常細胞を含む96検体、128アレイ • DLBCLの予後予測(Rosenwald. et.al. 2002) • 240検体(モデル構築160,モデル検証80)

24. 背景因子 (Rosenwald, A. 2002)

25. クラスター分析結果 (Rosenwald, A. 2002)

26. サブグループごとの生存曲線 (Rosenwald, A. 2002)

27. 予後予測スコアモデルの構築 • Cox回帰による遺伝子スクリーニング • 7399個中670個が1%有意 • 並べ替え検定により670個以上の遺伝子が1%有意となる確率は0.005 • gene expression signatureに含まれる遺伝子で対象者間のバラツキの大きいものを抽出し、発現量の平均を取る(gene expression signature value) • 各gene expression signature valueによるモデル化

28. 抽出された遺伝子と予後予測モデル score =- 0.290 * germinal-center B-cell - 0.311 * MHC class II - 0.249 * lymph-node + 0.241 * proliferation + 0.310 * BMP6

29. 予後予測スコアによる層別 (Rosenwald, A. 2002)

30. IPIスコア分類による層別

31. IPIスコア0-1群における予後予測スコアによる層別IPIスコア0-1群における予後予測スコアによる層別 (Rosenwald, A. 2002)

32. IPIスコア2-3群における予後予測スコアによる層別IPIスコア2-3群における予後予測スコアによる層別 (Rosenwald, A. 2002)

33. IPIスコア4-5群における予後予測スコアによる層別IPIスコア4-5群における予後予測スコアによる層別 (Rosenwald, A. 2002)

34. 予後予測研究における問題点 • gene expression signatureに含まれる遺伝子選択の恣意性 • モデル構築において、gene expression signatureから遺伝子を選択する恣意性 • 予後予測研究におけるサンプルサイズ設計 • 構築したモデルは臨床上有用か • サンプルの選択に依存するのではないか？

35. 今後の課題 • 様々な がんにおける遺伝子発現と予後予測 • 特に生存など臨床上重要な結果との関連 • マイクロアレイの特徴を考慮した解析法 • 測定の標準化 • 遺伝子スクリーニングを伴ったサンプルサイズ設計 • 抗癌剤の新規標的や著効または毒性発現が予測されるサブグループの探索 • 臨床現場への応用

36. まとめ • 遺伝子発現パターンを調べることは、疾患の鑑別診断、予後予測に有用 • 臨床試験の枠組みの中で評価していくことが重要

37. 参考文献 • Ramaswamy, S. and Golub, T.R. (2002). DNA microarray in clinical oncology. Journal of Clinical Oncology20, 1932-1941. • Simone, N.L. et.al. (1998). Laser-capture microdissection: opening the microscopic frontier to meolecular analysis. Trends in Genetics14, 272-276. • Lee, M.T. et.al. (2000). Importance of replication in microarray gene expression studies: Statistical methods and evidence from repetitive cDNA hybridizations. Proceedings of the National Academy of Sciences97, 9834-9839. • Kerr, M.K. and Churchill, G.A. (2001). Experimental design for gene expression microarrays. Biostatistics2, 183-201. • Golub, T.R. et.al. (1999). Molecular classification of cancer: Class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science286, 531-537. • Armstrong, S.A. et.al. (2002). MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nature Genetics30, 41-47. • Alizadeh, A.A. et.al. (2000). Distinct types of diffuse large B-cell Lymphoma identified by gene expression. Nature403, 503-511.

38. 参考文献 • Rosenwald, A. et.al. (2002). The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine346, 1937-1947. • Catovsky, D. et.al. (1991). A classification of acute leukaemia for the 1990s (Leading article). Annals of Hematology62, 16-21. • Pui, C-H. et.al. (1991). Clinical characteristics and treatment outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia with the t(4;11)(q21;q23): A collaborative study of 40 cases. Blood77, 440-447. • The International Non-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project. (1993). A predictive model for aggressive non-Hodgkin’s lymphoma. The New England Journal of Medicine329, 987-994.