BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA - PowerPoint PPT Presentation

slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA PowerPoint Presentation
Download Presentation
BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA

play fullscreen
1 / 91
BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA
308 Views
Download Presentation
charis
Download Presentation

BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA JAUNĀ BIOTEHNOLOĢIJA I. Muižnieks, 2013. g.

  2. ĢENĒTISKI MODIFICĒTI AUGI PĀRTIKĀ Galvenie ģenētiskie elementi, kurus izmanto ĢM augu ieguvē: gēni, to kodētās pazīmes un izcelsme, regulācijas elementi un to darbības īpatnības, plašāk lietotās vektorsistēmas, augu šūnu transformācijas metodes, augu organismu reģenerācijas metodes; ĢM augu daudzveidība: galvenajās ĢM augu grupas un to īpašības, bioķīmiskie mehānismi, kuri nodrošina modifikāciju; ĢM augu izplatības dinamiku pasaules lauksaimniecībā. Jaunās ĢM organismu iegūšanas metodes ĢM augu izmantošanu regulējošie tiesību akti.

  3. ĢENĒTISKĀS MODIFIKĀCIJAS MOLEKULĀRIE PAMATI GĒNS - NUKLEOTĪDU SECĪBA, KAS KODĒ PROTEĪNA STRUKTŪRU O P KODĒJOŠĀ DAĻA T GĒNA DARBĪBU REGULĒ: P - promoters, nukleīnskābes rajons, kurā sākas gēna informācijas pārrakstīšana par mRNS O - operators, nukleīnskābes rajons, kas regulē promotera aktivitāti T - terminators, nukleīnskābes rajons, kurā tiek pārtraukta gēna transkripcija

  4. Augu šūnas īpatnības: šūnas siena; organellas; vakuolas; transporta signālsecības

  5. Hloroplastu genoma izmēri - ~ 70 - ~ 220 k.b.p., vidēji 160 k.b.p. Annals of Botany 103: 625–633, 2009

  6. Augu mitohondriju genoma raksturojums (dzīvnieku – 15 – 18 k.b.p., sēņu – 18 – 78 k.b.p.) http://www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/plsc731/genome/genome8.htm Gēnu plūsma no mitohondrijiem un hloroplastiem uz kodolu

  7. ĢM AUGA IEGŪŠANA Regulatori Visā auga organismā aktīvie regulatori: Promoteri: CaMV 35 S RNA;nopalīna, oktopīna, manopīna sintāžu (nos, ocs, mas ), ubikvitīna, aktīna.NOS-terminators,

  8. Regulatori CaMV: Cauliflower mosaic virus (puķkāpostu mozaīkas vīruss) CaMV: 50 nm diametra kapsīds, ~ 8030 b.p. ds DNS ar vienpavediena pārrāvumiem, NS ~16% viriona masas. Inficē Cruciferae, Resedaceae, Solanaceae augu dzimtas, pārnesēji - laputis

  9. Regulatori CaMV replikācija notiek līdzīgi cilvēka B tipa hepatīta vīrusam: uz DNS matricas tiek sintezēta par genomu garāka 35 S RNS, kuru vīrusa revertāze atkal pārvērš DNS formā.

  10. http://www.patentlens.net/daisy/promoters/ext/navaggregator/navaggr.http://www.patentlens.net/daisy/promoters/ext/navaggregator/navaggr. Promotera patenti pieder Monsanto un Rokfellera universitātei

  11. Regulatori Ubikvitīns – visās eikariotu šūnās sastopams neliels (76 aminosk. atlikumi, 8564 Da) proteīns, ar kuru iezīmē proteosomās noārdīšanai paredzētos proteīnus http://www.patentlens.net/daisy/promoters/ext/navaggregator/navaggr. Patenti: Mycogen, Monsanto

  12. Regulatori Aktīns – visās eikariotu šūnās sastopams citoskeleta komponents, kas piedalās šūnas formas veidošanā, kustību un dalīšanās procesos

  13. Regulatori Alkoholdehidrogenāzes promotera inducējama sistēma.Citas inducējamas sistēmas – tet, glikokortikoīdu hormoni, metālu joni, vides stress, gaisma Alcohol dehydrogenase I (Adh-I) encoded by the alc A gene; transcriptional activator protein AlcR; ethanol, ethyl methyl ketone or other alcohols/ketonesact as inducers of the gene expression. Patents - Syngenta

  14. Regulatori Sēklu specifiski promoteri http://biopharminternational.findpharma.com/biopharm/article/articleDetai Plant Biotechnology Journal (2010) 8, pp. 588–606

  15. Regulatori Agrobacterium inducētie sakņu audzēji Agrobacterium Ti plazmīda nos - nopalīna sintēzes gēna terminators no Agrobacterium Ti plazmīdas Nopalīns helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/crown.htm

  16. Nesēji - vektorplazmīdas • Selekcionējamie marķiergēni - rezistences • kanamicīna vai G148: • neomicīna fosfotransferāze (npt II), • higromicīns B: higromicīna fosfotransferāze (hyg B), • gentamicīns :gentamicīna acetiltransferāze, • streptomicīns : • streptomicīna fosfotransferāze, • - fosfinotricīns (basta, bioalofoss, glufosināts): fosfinotricīna acetiltransferāze (pat).

  17. Nesēji - vektorplazmīdas Pēc transgēna iegūšanas slekcijas marķierus vairs nevajag. Selekcijas marķiera klātbūtne apgrūtina tālāko rīcību ar transgēnu. Selekcijas marķieris (piem., antibiotiku rezistence) apgrūtina transgēna izmantošanu. Transgēni augi bez selekcijas marķieriem. Transformācija bez marķiera vai MAT vektori (multi-auto-transformation).

  18. ipt gēns – citokīnu produkcija rol gēns – bārkšsakņu veidošanās R /Rs – rauga saitspecifiskas rekombinācijas sistēma ar inducējamu promoteru Ebinuma. Komamine, 2001

  19. ĢM AUGA IEGŪŠANA AUGU TRANSFORMĀCIJA Augu audu un veselu augu apstrāde makroinjekcija; mērcēšana; apstrāde ar baktērijām vakumā. Protoplastu apstrāde PEG klātbūtnē; ar mākslīgajām liposomām; elektroporācija; sapludināšana. Augu šūnu un šūnu kultūru apstrāde mikroinjekcija;balistiskā (biolistics) transformācija; agrobaktēriju metodes.

  20. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes

  21. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Apstrādājot ar celulāzēm un pektināzēm, iegūst augu protoplastus

  22. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Balistiskā transformācija

  23. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Balistiskā transformācija

  24. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Agrobaktēriju sistēma Arī dabā agrobaktērijas inficē augus un integrē to hromosomās savu genomu, veidojot t.s. “rētu audzējus” un “bārkšsaknes”.

  25. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Agrobaktēriju sistēma

  26. ĢM AUGA IEGŪŠANA Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Transformācijas procesu regulē apm. 100 baktēriju gēni: baktērijas piesasitīšanās pie auga šūnām (adhēzija); plazmīdas pārnese; plazmīdas nokļūšana šūnas kodolā (nuclear targeting); integrācijas mērķa secību izvēle genomā. Insercijas notiek transkripcionāli aktīvā hromatīnā.

  27. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Agrobaktēriju sistēma

  28. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes no Escherichia coli Agrobacterium divplazmīdu sistēma. Virulences plazmīda un klonējamo gēnu kasete

  29. ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes

  30. ĢM AUGA IEGŪŠANA Auga organisma reģenerācija Diferencētas augu šūnas saglabā totipotenci – spēju de- un rediferencēties, reģenerēt veselu auga organismu

  31. ĢM AUGA IEGŪŠANA Auga organisma reģenerācija

  32. ĢM AUGA IEGŪŠANA Auga organisma reģenerācija

  33. Auga organisma reģenerācija • Fitohormoni: • inolil-3-etiķskābe (auksīns) • citokinīni • giberelīni • etilēns • abscisskābe

  34. Auga organisma reģenerācija Auksīnu iedarbība (apikālās dominances likvidēšana): sānsakņu un piesakņu veidošanās; augļu veidošanās; fototropisms; lapu un ziedu krišana; DNS sintēze.

  35. Auga organisma reģenerācija Fitohormoni Auksīni Indoliletiķskābe, IAA;Indolilsviestskābe, IBA;Naftilēnetiķskābe, NAA;2,4 dihlorfenoksietiķskābe, 2,4-D

  36. Auga organisma reģenerācija • Citokinīnu iedarbība: • šūnu dalīšanās (citokinēze); • orgānu attīstība – asnu veidošanās; • novecošanas kavēšana, hloroplastu veidošanās; • sānu pumpuru veidošanās; • āuksīnu inducētās stiepšanās inhibīcija.

  37. Auga organisma reģenerācija Fitohormoni Kinetīni

  38. Auga organisma reģenerācija Giberelīnu iedarbība (līdzība ar augu patogēnās sēnes Giberella fujikuroi=Fusarium moniliforme iedarbību): sēklu dīgšana; stiepšnās garumā.

  39. Auga organisma reģenerācija Fitohormoni Giberilīni

  40. Auga organisma reģenerācija Fitohormoni

  41. ĢM AUGA IEGŪŠANA AUGU KONSTRUĒŠANA

  42. ĢM AUGA IEGŪŠANA AUGU KONSTRUĒŠANA

  43. ĢM augu šķirņu izveides process Laišanatirgū Tehnoloģijas izveide Pētījumi Sanie-dzamie mērķi Ražošanaseksperimenti Gēnu atrašana un raksturošana Gēna funkcijasapstiprināšana In planta Tehnoloģijasizveide Tehnoloģijasizveide Tehnoloģijas izveide Ražošanasuzsākšana Ražošanas izvēršana 1-? gadi 1-2 gadi 1-3 gadi 1-2 gadi 1-2 gadi 1 gads 6 - 11 gadi • Kritēriji darba rezultātiem katrā posmā • Bioloģiskā un biotehnoloģiskā efektivitāte • Atbilstība likumiskās regulācijas prasībām • Vides, veselības un drošības apsvērumi • Administratīvais un sociālais atbalsts • Sekmīga darbība mēroga palielināšanā (rajonēšana) • Oficiālās izplatīšanas atļaujas saņemšana • Panākumi komercializācijā

  44. ĢM augu šķirņu attīstība • ĢM augu paauudzes: • modeļorganismi • labākas audzēšanas tehnoloģijas, herbicīdu, kukaiņu izturība • vakcīnas un terapeitiskie proteīni • palielināta pārtikas vērtība • izturība pret sēņu un baktēriju slimībām • izturība pret sausumu un sāls stresu 1982 – pirmais ĢM augs – Km-rezistenta tabaka 1985 – pirmie lauka izmēģinājumi ar ĢM augiem 1990 – pirmā vakcīna no augiem: SpaA proteīns tabakas lapās 1992 – sēņu un baktēriju infekciju rezistence augiem 1994 – pirmais ĢM augstirgū – FS tomāti 1996 – Bt-kokvilna, kukurūza; herbicīdu rezistenta soja, kokvilna, kukurūza un rapsis 1997 – PHB kukurūza (neizdodas attīrīt) 1999 – zelta rīss

  45. ĢM PĀRTIKAS VEIDI • Pārtika ar uzlabotu uzturvērtību: • tomāti ar paaugstinātu vitamīnu saturu; • zemesrieksti ar samazinātu alergēnu daudzumu; • kartupeļi ar uzlabotu cietes sastāvu; • kvieši ar palielinātu folskābes daudzumu; • rīsi ar palielinātu A vitamīna provitamīna saturu; • sojas eļļa ar augstu oleīnskābes saturu; • rapšu eļļa ar augstu laurīnskābes sāļu saturu.

  46. AUGU IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ: PRIEKŠROCĪBAS 1. Šķirņu (ģenētisku marķieru) daudzveidība 2. Lielspēcnācēju skaits 3. Reģenerācijas spējas, fitohormonu vienkāršība 4. Šūnu kultūru īpatnības 5. Ētiski motīvi

  47. AUGU IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ: TRŪKUMI 1. Šķirņu un kultivāru ģenētiskais neviendabīgums, poliploīdija (kartupeļu paveidu hromosomu n 24…144) 2. Somatoklonālā variēšana 3. Sarežģījumi ar viendīgļlapjiem 4. Organellu genomu daudzveidība un izmēri 5. Ētiski motīvi

  48. ĢM augu daudzveidība

  49. Global Review of Commercialized Transgenic Crops. Clive James, Jan. 2012, ISAAA