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補足:分子量の求め方

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補足:分子量の求め方. 二次元電気泳動の基本. SDS - PAGE の泳動像から分子量を推定するには?. タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質の ものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる. 同じゲルの中で既知のタンパク質(分子量マーカー)を泳動する. 分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する 移動距離を片対グラフにプロットする. これを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求める. SDS-PAGE の分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質. サンプル. 分子量マーカー.

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Presentation Transcript
slide1
補足:分子量の求め方

二次元電気泳動の基本

sds page
SDS-PAGEの泳動像から分子量を推定するには?SDS-PAGEの泳動像から分子量を推定するには?

タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質の

ものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる

同じゲルの中で既知のタンパク質(分子量マーカー)を泳動する

分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する

移動距離を片対グラフにプロットする

これを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求める

sds page1
SDS-PAGEの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質SDS-PAGEの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質
slide4

サンプル

分子量マーカー

分子量算出の手順~バンドが綺麗に揃ったゲルの場合~分子量算出の手順~バンドが綺麗に揃ったゲルの場合~

1)分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの

移動距離を正確にはかる

3.6

6.7

12 .7

23.6

33.5

44.6mm

slide5

2)片対グラフの横軸(普通目盛)に移動距離、縦軸(対数目盛)に分子量  をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする2)片対グラフの横軸(普通目盛)に移動距離、縦軸(対数目盛)に分子量  をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする

3)移動度-分子量標準曲線を求める

slide6

サンプル

分子量マーカー

28.5mm

4)目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる

5)その数値を3)で求めた標準曲線の式(y=267249x-0.7341)に代入し

  分子量を算出する

267249×28.5 -0.7341=22851.49

求めるタンパクの分子量

slide7

サンプル

分子量マーカー

分子量算出の手順~スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合~分子量算出の手順~スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合~

1)分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの

移動距離を正確にはかる

2)レーンの同じ場所で泳動のフロントラインの移動距離を正確にはかる

BPB

slide8

サンプル

分子量マーカー

0.25

0.67

1.0

3)フロントラインの移動距離を1として、それぞれの分子量マーカーのバン  ドの移動距離の相対値(=相対移動度:Rf値)を計算する

slide9

4)片対グラフの横軸(普通目盛)にRf値、縦軸(対数目盛)に分子量を4)片対グラフの横軸(普通目盛)にRf値、縦軸(対数目盛)に分子量を

とり 、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする

5)Rf値-分子量標準曲線を求める

slide10

7)目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる7)目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる

8)そのサンプルが流れているレーンの同じ場所で、泳動のフロントライン    の移動距離をはかる

9)フロントラインの移動距離を1として、目的のタンパク質のRf値を計算し

  5)で求めた標準曲線の式(y=15154x-0. 7425)に代入すると、分子量が

  算出できる

サンプル

分子量マーカー

0.57

1.0

15154×0.57 -0.7425=22771.73

求めるタンパクの分子量

sds page2

S-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れるS-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れる

SDS-PAGEで分子量を測定する上での注意点

・塩基性に富んだタンパク質はSDSの結合量が少なくなるため、移動度が

小さくなる=見かけの分子量が大きくなる

・タンパク分子内に疎水性に富んだ部分が多い場合は、SDSの結合量も

 多くなり、移動度が大きくなる=見かけの分子量が小さくなる

・糖タンパク質や酸性タンパク質はSDSの結合量が少なく、移動度も小さい

 =見かけの分子量が大きくなる

・多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子では、SDS-PAGEで

わかるのはその単一ポリペプチドの分子量だけで、その分子が生体内で

機能している状態の分子量はわからない

例)  免疫グロブリン=重鎖2本と軽鎖2本がS-S結合した構造をもつ

slide13

L鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれているL鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれている

免疫グロブリンの構造

2本のL鎖と2本のH鎖で

構成されている

黄色い部分=Light chain

             (L鎖)

緑色の部分=Heavy chain

             (H鎖)

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