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实验九：细胞凋亡的形态和生化特征观察. 实验目的. 1. 掌握细胞凋亡的形态特征。 2. 学会根据染色质的凝聚程度 , 是否形成凋亡小体和细胞膜通透性变化 , 鉴别凋亡细胞 , 坏死细胞及正常细胞。. 实验原理. 细胞死亡分为 2 种类型 : 程序性细胞死亡或称细胞凋亡。凋亡细胞的膜保持完整性 , 但染色质高度凝聚 , 有些凝聚块附着于核膜上 , 使细胞和核的外形发生改变 , 并产生出大小不同被膜包围的凋亡小体 ; 正常细胞的膜保持完整 , 且染色质较均匀分布 ; 坏死细胞的膜损伤 , 染色质凝聚程度远低于凋亡细胞。. 仪器、材料和试剂.
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实验目的 • 1.掌握细胞凋亡的形态特征。 • 2.学会根据染色质的凝聚程度,是否形成凋亡小体和细胞膜通透性变化,鉴别凋亡细胞,坏死细胞及正常细胞。
实验原理 • 细胞死亡分为2种类型:程序性细胞死亡或称细胞凋亡。凋亡细胞的膜保持完整性,但染色质高度凝聚,有些凝聚块附着于核膜上,使细胞和核的外形发生改变,并产生出大小不同被膜包围的凋亡小体;正常细胞的膜保持完整,且染色质较均匀分布;坏死细胞的膜损伤,染色质凝聚程度远低于凋亡细胞。
仪器、材料和试剂 • （一）仪器荧光显微镜,CO2培养箱冰箱,超净工作台,倒置显微镜和离心机等。 • （二）材料 • 体外培养细胞,微量加样器(1 µL-1mL),0。5mL和1。5mL的微量离心管,20 µL。200 µL和1mL吸头,10mL培养瓶,载玻片,盖玻片等。 • （三）试剂 • HT浓度为1mg/mL的针剂;荧光探针;用PBS(pH7。4)将PI配成500ug/mL的储液,用蒸馏水将Ho。33342配成1mg/mL的储液,2种储液都在-20℃冻存。
实验步骤 • 1.在超净工作台中进行无菌操作。 实验前约24h,接种3瓶培养细胞,每瓶含6mL培养基。在37℃,5％CO2培养箱中培养。 • 2.当细胞密度达70-80％时(对数生长期),每瓶约有106个细胞。用无菌离心管离心(1000r/min,5min)收集细胞,弃上清,分别用6mL培养基重悬细胞,用移液管轻轻将细胞悬液移回原培养瓶中,分别进行处理:1号瓶(对照组)加入PBS(pH7。4)6 µL;2号瓶(加药组)加入HT储液6 µL,使HT终浓度为1ug/mL;3号瓶不加任何试剂。
3.加药后放入培养箱培养2.5h。 • 4.从1号培养瓶中取出178 µL细胞悬液加到1号微量离心管中;从2号培养瓶中取出178 µL细胞悬液加到2号微量离心管中。 • 5.向2个微量离心管中都加入两种荧光探针:Ho33342储液加2 µL(终浓度为10ug/mL);PI储液加20 µL(终浓度为50ug/mL),混匀,37℃温箱中标记20-30min。
6.将2微量离心管1000r/min,离心5min,余少量上清(约20 µL)悬液细胞(用手指弹微量离心管底)。 • 7.从微量离心管1(对照组)取10 µL细胞悬液,滴加到载玻片上,盖上盖玻片。从微量离心管2取10 µL细胞悬液,滴加到载玻片上,盖上盖玻片。两组各做2张片子,都作好标记,保存于暗盒中。
8.在荧光显微镜下,先用透射光观察,找到焦面后,再用紫外光激发,40×荧光物镜观察。根据荧光的颜色和细胞的形态进行记录,应看到对照组中的细胞核质均匀,发蓝色荧光;加HT组分3种情况:很多凋亡细胞出现染色质凝聚,边缘化,有凋亡小体,发蓝色荧光;也有些正常细胞与对照组相同,还有少量细胞为坏死细胞,发红色荧光。8.在荧光显微镜下,先用透射光观察,找到焦面后,再用紫外光激发,40×荧光物镜观察。根据荧光的颜色和细胞的形态进行记录,应看到对照组中的细胞核质均匀,发蓝色荧光;加HT组分3种情况:很多凋亡细胞出现染色质凝聚,边缘化,有凋亡小体,发蓝色荧光;也有些正常细胞与对照组相同,还有少量细胞为坏死细胞,发红色荧光。 • 9.3个培养瓶中余下的细胞,留做琼脂糖凝胶电泳实验。
注意事项 • 荧光标记的细胞悬液滴片时,注意载玻片要洁净,悬液量要充满于盖玻片下,但不要产生气泡,多余的要有滤纸条从盖玻片边缘吸去,否则细胞将飘浮运动,不易观察。 • 两种荧光探针的储液都分装在微量离心管中,-20℃冻存,用前在室温下融化,荧光探针的储存和标记都要保持在暗环境中。紫外光是强激发光,极易漂白荧光。可在荧光观察前,先用透射光找到细胞焦面,再关掉透射光照明,开启紫外光激发样品。
【实验报告】 • 根据观察,画出几种细胞典型图像。 【思考题】 • 总结凋亡细胞的形态特征 • 试述本实验鉴别凋亡细胞,坏死细胞和正常细胞的原理。
二.培养细胞凋亡的生化特征观察 【实验目的】 1.了解凋亡细胞的生化特征 2.学会制作DNA ladder的一种方法
实验原理 • 由于大多数程序性死亡的细胞中,内源性核酸内切酶活化,核DNA随机在核小体的连接部位被打断,成为寡聚核小体,若对核DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder特征;相比之下,正常细胞的DNA不降解,电泳条带表现为一大分子片段;坏死细胞的DNA虽然也存在降解,但由于存在各种长度的DNA片段,无法形成梯状带纹,表现为连续分布的弥散条带。
仪器、材料与试剂 • （一）仪器微量加样器,恒温水浴锅,高速离心机,电泳仪和电泳槽,暗箱式紫外透射仪,微量离心管,吸头。 • （二）材料 • 体外培养细胞, • （三）试剂 • 酚,氯仿,TE(pH 8.0),抽提缓冲液,EDTA,蛋白酶K,RNA酶,Tris-Cl,SDS。
实验步骤 一.提取细胞DNA 1.将上面实验留下的3瓶细胞,按原实验分组的顺序,分别作为(1)对照组;(2)加药组;(3)坏死组。 2.将3瓶细胞离心(1500r/min,5min)收集后分别移入3个1.5mL微量离心管中,以下的步骤3个样品同样操作。 3.用机械吹打法制成细胞悬液， 8000～10000 rpm离心收集细胞沉淀； 加入1mL抽提缓冲液[10 m mol/L Tris-Cl (pH 8.0), 0.1 mol/L EDTA (pH 8.0), 0.5 % SDS], 轻轻摇匀，形成匀浆状；
4.将匀浆液转入5mL离心管中，加入Proteinase K至终浓度100 µg/mL，50℃水浴保温5～8h;直到细胞全部溶解，液体变清亮为止； 5.加入等体积平衡酚，温和振荡，摇匀，置-20 ℃ 5～10min; 10 000 rpm离心10 min，将上层水相移至洁净的离心管中； 6.用酚:氯仿（1 : 1）抽提1次；然后用氯仿抽提一次；
7.移出水相，加入2倍体积乙醇使DNA形成沉淀；然后用70 %乙醇洗涤DNA沉淀2次，尽可能除去70 ％乙醇； 8.用牙签将DNA沉淀从乙醇中移出，凉干； 9.加入500 µL TE (pH 8.0) 使DNA完全溶解；加入RNA酶至终浓度50 µg/mL，37 ℃下保温4 h。
琼脂糖凝胶电泳 • 1.配制凝胶和胶板制备 • 配制所需的电泳缓冲液(通常为0.5×TBE) • 在锥形瓶中根据需要加入一定量0.5×TBE电泳缓冲液,加入使终浓度为1％琼脂糖粉,瓶口封住,在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。 • 将温热的琼脂糖溶液倒入胶膜中,凝胶的厚度在3-5mm之间。不要有气泡。
2.凝胶凝固后,在加样孔加入10 µLDNA加入2 µL加样缓冲液。 3.电泳 4.EB染色10-15min 5.观察和摄影:切断电源,从电泳槽中取出电泳凝胶床,将凝胶置于紫外透射仪下观察电泳结果。
注意事项 • 操作要温和,防止大分子DNA被打断,影响实验结果。 • 根据实验的具体情况,对琼脂浓度,电泳条件进行预实验。 • EB可嵌入双链核酸中,是一种诱变剂,操作时要戴手套,如果粘到手上,要及时用大量清水冲洗。
实验报告 • 画出你观察到的凋亡,坏死及正常细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱。 思考题 • 试述凋亡细胞的生化特征。
