Dr. Nurdan Köktürk Dr. Salih Emri Dr. Pınar Fırat Dr. Hadi AKAY Dr. Cem Kadılar Dr. Can Öztürk

1. Asbeste ve Erionite Bağlı Maliğn Plevral Mezotelyoma Patogenezinde Apoptosis ve Apoptosis Regüle Edici Proteinlerin Rolü Dr. Nurdan Köktürk Dr. Salih Emri Dr. Pınar Fırat Dr. Hadi AKAY Dr. Cem Kadılar Dr. Can Öztürk Dr. Faruk Zorlu Dr. Yücel Güngen Gazi Üniversitesi Hacettepe Üniversitesi Ankara Üniversitesi Kooperatif Çalışma Grubu TUBITAK Proje No:SBAG-2567(102S045) Kokturk N, Emri S, Firat P, et al. Prognostic significance of Fas Ligand and Bax in erionite and asbestos induced Turkish malignant pleural mesothelioma.Submited for publication to Lung Cancer.

2. Giriş Türkiye’de Malignant Plevral Mezotelyoma(MPM) • Türkiye’de endemik lifsel-yapılı plevral ve pulmoner hastalıkların prevalansı yüksektir (fiber-related pleuropulmonary disease). • Yol açan nedenler: • Aşırı nüfus kalabalığı • Jeoloji • Asbest madeni yığınları • Orta Anadolu’da Kapadokya bölgesinde 3 köyde tanımlanan diğer bir mineral lif; Erionite varlığı 1. Baris YI. Asbestos and erionite related chest diseases. Ankara, Semih Ofset Matbaacılık, 1987.

3. Erionite ve Tremolite MPM’leri Arasındaki Farklılıklar :Ras Oncoprotein Ekspresyonu Fig 1. Positively stained tumor cells in case 3 İndicating Ras expression.Inset: Positive control showing dense staining Fig 2. Representative immunoblots of p21 ras-negative plasma (Lane 1), p21ras-positive plasma (Lane 3,4,5) and molecular marker (Lane M). • Erionite mezotelyomaların da Ras oncoprotein ekspresyonu % 27, tremolite mezotelyomaların da ise %6 olarak bulunmuştur (P=0.17). 1.Olut A, et al. Respir Med 2001; 95: 697-698.

4. Erionite ve Tremolite MPM’leri Arasındaki Farklılıklar :Prognostik faktörler • Akım sitometrik DNA analizi ile Erionite mezotelyomalarında aneuploidy oranı istatiksel olarak önemli derecede yüksek bulunmuştur [erionite MPM %72.7(8/11) vs. Tremolite MPM %13.8(4/29)]. • İstatiksel olarak önemli olmasa da Erionite MPM’da proliferasyon hızı [proliferation rate (SPF)] daha yüksektir. • 1. Emri S, and et al. Lung Cancer 2001;33: 109-114.

5. Erionite ve Tremolite MPM’leri Arasındaki Farklılıklar:Tedaviye Yanıt ve Survi Median OS(ay± %95CI):10±(6-14) Erionite: 8±2(3-13), 1-y sur % 30.0 Asbestos: 14 ±3(9-19), 1-y sur % 51.9 • Tremolite MPM’lerinde survi avantajı gösterilmiştir. • Erionite MPM’lerinin tedaviye yanıtları daha kötüdür. • 1. Emri S, and et al. Lung Cancer 2001;33: 109-114.

6. Erionite’in karsinojenik özellikleri ve/veya genetik faktörler erionite mezotelyomalarının bu değişik biyolojik davranışından sorumlu olabilir.

7. Mineral Lif Karsinogenezi Asbest veya Erionite G1/S G2/M S GrowthArrest/ Survival 1.Serbest radikal 2.Mekanik etki p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor) DNA HASARI p53 bax APOPTOSIS bcl Ölüm ve Yaşam Kararı Malignant Transformasyonun kalbini teşkil etmektedir!

8. APOPTOSİS • Apoptosis “programlı hücre ölümü”; hücrenin kendi ölümünü sağlayan ve o hücre tarafından başlatılan ve sürdürülen bir dizi genetik olay için kullanılan bir terimdir. • Programlı hücre ölümü (apoptosis) gelişmesindeki defektlerin tümör gelişimi ve kemoterapiye olan dirençte mojör rolü olduğuna inanılmaktadır. • Xia C ,and et al. Mol Cancer Ther 2002; 1: 160-166. • LaCasse EC, and et al. Oncogene 1998; 275: 5315-5320.

10. APOPTOSİS • Apoptosisi belirleyen iki büyük protein grubu vardır: • bcl-2 ailesi ve • caspase ailesi.

11. Bcl-2 Ailesi

12. Bcl-2 Kanser Hücre Ölümünü Önler  Bcl-2/bax: Kötü prognoz Ve yüksek tümör grede’i ↓Bcl-2/Bax :Düşük tümör Grade’i ve kemoterapiye Daha iyi cevap ve relaps azlığı

13. Apoptosis-Caspase • Apoptosis intracellüler proteinlerin yıkımı ile gerçekleşir. Caspase(Cysteinyl-aspartic acid proteases) ailesi bu proteinleri yıkan proteazlara verilen isimdir. • Caspase yolu bir kez aktive olduğunda, birbirini tetikleyen bir dizi reaksiyon başlatılmış olur.

14. Apoptpsis Sık Görülen Yolak Cytochrome c Caspase Activation Cell Death

15. Apoptosis- CD 95 • Fas (CD95/APO 1) hücre yüzey reseptörüdür, spesifik ligandı olan Fas ligand ile bağlanarak Caspase 8 yolunu aktive ederek apoptotic hücre ölümünü indükler.

16. Çalışmanın Amacı • Bu çalışmada apoptosis de en güçlü yolaklardan ikisine ait belli başlı proteinlerin; Bcl-2, Bax, Fas/Fas Ligan’ın erionit ve asbestle indüklenmiş MPM’lı olgulardaki ekspresyonlarının değerlendirilmesi ve bunun yaşam süreleri ile olan ilişkisinin ortaya konması hedeflenmiştir.

17. Materyal ve Metod-1 • Çalışma Populasyonu • 16 (%30.7) erionit ve 19 (%36.5) asbeste bağlı mezotelyoma olgularından oluşan toplam 35 malign plevral mezotelyoma (MPM) ve 17 (%32.6) adenokarsinomalı hasta çalışmaya alındı. • Patolojik İnceleme • Formalinde sabitlenmiş parafine gömülü dokular 5 mikronluk kesitler şeklinde kesildi. Dokular önce H&E boyası ile boyandı. MPM hücre tiplendirmesi yapıldı. Daha sonra immunhistokimyasal analiz için immun boyamalar yapıldı.

18. Materyal ve Metod-2 Boyanmalar: 0= boyanma yoğunluğu (yok: hiç boyanma yoksa), 1=hafif boyanma varsa, 2= orta düzeyde boyanma varsa, 3= kuvvetli boyanma varsa Boyanan hücrelerin tüm tümoral dokuya oranına göre, boyanma alanı (%) olarak semi kantitatif olarak değerlendirildi.

19. Materyal ve Metod-3 • İstatistiksel Analiz • İstatistiksel değerler ortalamastandard sapma olarak verildi. İstatistiksel analiz için SPSS “Windows Sürüm 10.01 (1999)” paket programı kullanıldı. Ki kare, Fisher’in ki kare testi, Kruskal Wallis ANOVA ve Mann Whitney U testi karşılaştırmalar için kullanıldı. Survi analizi için Kaplan Meier analizi yapıldı. P<0.05 olması hali istatistiksel fark olarak kabul edildi.

20. Sonuçlar-1

21. Sonuçlar-2

22. Sonuçlar-3

23. Sonuçlar-4

24. Sonuçlar-5

25. Fas Ligand Ekspresyonu ve Survival Analizi(Tüm Grup) • Fas Ligand ile pozitif boyanan hastalar ise Fas Ligand negatif hastalara göre tüm MPM grubu dikkate alındığında daha uzun yaşarlar (15-12 ay, p=0.05).

26. Erionite MPMP’lerinde Bax ekspresyonu ve survival • Erionite MPM’lerinde Bax negatif hastaların survisi daha uzun bulunmuştur(18 vs. 14 ay; p=0.06). .

27. Tartışma-1 • Şu ana kadar yapılan ilk çalışmadır. • Bizim çalışmamızda da Bcl-2 uygun boyanan pozitif kontrole ve pozitif iç kontrole rağmen sadece birkaç dokuda pozitif saptanmıştır. • Bax boyanma ise yaygındır, ancak boyanma yoğunluk ve yüzde olarak 3 grup arasında farklı değildir. • Bax daha önce hücre dizilerinde yapılan bir çalışmada tüm MPM dizilerinde yüksek bulunmuştur ancak, proapoptotik bir protein olmasına rağmen, fonksiyonel olarak yetersiz olduğu gibi bir yorum yapılmıştır.

28. Tartışma-2 • Şu ana dek yapılan çalışmalarda protein ekspresyonları ile yaşam süresi arasındaki ilişki sadece bir çalışmada işlenmiştir. Buna göre Bax ya da Bcl-2 ile yaşam süresi arasında bir ilişki kurulamamıştır. • Bizim çalışmamızda ise Bax ekspresyonu ile yaşam süresi arasında yalnızca erionit grubunda ters bir ilişki saptanmıştır.

29. Tartışma-3 • Bax’ın proapoptotik bir protein olması nedeniyle bu bilgi beklenmeyen bir bulgu gibi algılanabilir ancak daha önce Narasimhan ve ark.nın bulgularını destekler biçimde Bax’ın özellikle erionitle oluşan MPM’de nonfonksiyonel olması ya da diğer antiapoptotik proteinlerin bu yolu ara yol olarak kullanıyor olması muhtemeldir. • Bu erionit grubunda apoptotik mekanizmalardaki olası bir farklılığa işaret edebilir ve ileri araştırmaların gerekliliğini vurgular.

30. Tartışma-4 • Fas sisteminin MPM deki etkilerini çalışan yayınların sayısı son derece azdır. Stewart ve ark. Fas/Fas L yolunun MPM’de intakt olduğunu ve kemoterapötikler ile indüklenebileceğini belirtmişlerdir. • Bizim çalışmamızda Fas ekspresyonu yok denecek kadar sınırlıdır. Bu bulgu adenokarsinomlar için de geçerlidir. Fas ligand ise oldukça iyi eksprese olmuştur.

31. Sonuç • Sonuç olarak bulgularımız Bcl-2’nun MPM tümör biyolojisine katkıda bulunmadığını, Bax ekspresyonunun sadece erionit grubunda kötü prognoz kriteri olduğunu göstermektedir. • Bu bulgu erionitle oluşan MPM’nın asbestle oluşan MPM’dan farklı olduğuna işaret edebilir. • Artmış Fas Ligand ekspresyonu MPM grubunda iyi prognoz ile ilişkilidir. • Bu bulguların desteklenmesi amaçlı erionit ve asbestle indüklenmiş MPM hücre dizilerinde yapılan ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.