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第六章 DNA 序列分析

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第六章 DNA 序列分析. 人类基因组计划 (human genome project, HGP). 人类基因组计划 (human genome project, HGP) 是由美国科学家于 1985 年率先提出,于 1990 年正式启动的。总体计划在 15 年内投入至少 30 亿美元进行人类全基因组的分析。. 美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与。. 我国承担其中 1% 的任务,即人类 3 号染色体短臂上约 30 亿个碱基 的测序任务。. 人类基因组. 线粒体基因组. 核基因组 ( 约 30 亿个碱基 ). 约 10%. 约 90%.

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Presentation Transcript
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人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出,于1990年正式启动的。总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析。

美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与。

我国承担其中1%的任务,即人类3号染色体短臂上约30亿个碱基的测序任务。

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人类基因组

线粒体基因组

核基因组(约30亿个碱基)

约10%

约90%

基因和基因有关序列

基因外序列

rRNA

基因

tRNA

基因

蛋白编码

基因

专一或中等重复序列

70~80%

20~30%

专一的或低

拷贝数序列

中度至高度重复序列

<10%

>90%

Coding DNA

Non-coding DNA

约60%

约40%

串联重复序列/

成簇重复序列

分散重复序列

内含子

假基因

基因片段

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序列测定的技术

经典方法:

Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)

Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)

新技术方法:

  • 杂交测序法
  • 质谱法
  • 单分子测序法
  • 原子探针显微镜测序法
  • DNA 芯片法
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Sanger双脱氧终止法

  • 与 PCR反应类似。
  • 反应体系中包含:模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物;
  • 反应过程:

变性-复性-延伸-终止

dideoxynucleotides
Dideoxynucleotides(双脱氧核苷酸)
  • ddNTPs 是反应终止剂

可以当作正常碱基参与复制,一旦链入DNA中,其后就不能再继续连接。

  • 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4 :1)。
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脱氧核甘酸

双脱氧核甘酸

结构比较

*

少一个-OH

H

sanger
Sanger第一步:加入复制终止剂

电泳,看谁跑得快

荧光检测探头

ddntps dna
ddNTPs参与下的DNA复制

Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP与dNTP的比例,比例高时,得到较短的产物;

gel electrophoresis dna fragment size determination
Gel ElectrophoresisDNA Fragment Size Determination

Sanger第二步:荧光检测

  • DNA 带负电
  • DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关
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除核苷酸序列文本文件外,全自动测序仪还提供曲线图。除核苷酸序列文本文件外,全自动测序仪还提供曲线图。

maxam gilbert
Maxam-Gilbert化学裂解法

一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解,其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子,从共同起点(放射性标记末端)延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后,各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。

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碱基特异性化学切割反应:
  • 硫酸二甲酯(DMS ):使DNA分子中鸟嘌呤(G)上的N7原子甲基化。
  • 肼:使DNA分子中胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的嘧啶环断裂;但高盐条件下,只C断裂,而不与T反应。
  • 哌啶:从修饰甲基处断裂核苷酸链。

在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下,三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。

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G反应:DMS使G在中性和高温条件下脱落。
  • G+A反应:酸性条件(如甲酸)可使A和G嘌呤环上的N原子质子化,利用哌啶使A、G脱落。
  • T+C反应:肼(低盐)
  • C反应:肼(高盐)

测定DNA长度~250bp。

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DNA片断序列测定的策略
  • 测定未知序列的DNA片断
  • 一次测序结果有长度限制(﹤1000bp)

通用引物指导未知序列的测定

引物步移

随机克隆测序

缺失克隆测序

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通用引物指导未知序列的测定

根据载体序列设计通用引物测定待测DNA片断

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引物步移策略

将待测DNA片断克隆在质粒载体上,利用引物步移延伸,从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定,直至另一端为止。

克服了鸟枪法的盲目性,并省去亚克隆制备步骤,也减轻了数据分析工作量。

但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序,才能合成适当的引物进行测序。

定向缺失克隆策略、染色体步查法等。

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鸟枪测序法(shotgun sequencing):随机克隆测序将待测的DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文库,然后通过通用引物测定每个克隆中的待测DNA序列。当这些已测序列的数量达到一定程度后,相当于待测DNA片断的每一部位的序列也就被测定出来了,通过这些所测序列之间的重叠部分,最终可将整个DNA片断的序列拼接出来,这样的测序策略称为随机克隆测序。

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将DNA大片段切割成小片段的三种方法:

限制性内切酶酶切

超声波处理

DNA酶I降解(加Mn2+)

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鸟枪法测序的缺点
  • 随着所测基因组总量增大,所需测序的片段大量增加,造成重复测定,也易丢失某些序列,且数据处理分析工作量大。
  • 高等真核生物(如人类)基因组中有大量重复序列,导致判断失误。
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基因组测序

完整基因组的测序过程一般包括三个步骤:

(1)建立克隆的物理图谱:如酵母人工染色体YAC(Yeast Artificial Chromosome)克隆、细菌人工染色体BAC(Bacterial Artificial Chromosome)克隆等;

(2)利用鸟枪法(Shotgun Strategy)测定每个克隆的序列;

(3)序列拼装和注释:当得到一段DNA序列之后,可以利用序列分析工具,进行序列的拼接;继而通过与数据库序列的比较,得到与该序列相关的信息,如基因、调控元件、重复区域等,进而对序列的生物学特性进行注释。

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DNA全序列

切成小段

小段和载体结合

结合后进行测序

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Map fragments

Sequence all fragments and assemble

Sequence overlappingfragments

Assembledsequence

基因组DNA序列测定示意图

通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱,并对重叠片段进行测序,通过“拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置,而是根据其重叠部分进行“拼装”。

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第四章作业:

Southern 、Northern 、Western 杂交、生物芯片技术、RNAi技术原理分别是什么?

第五章作业:

PCR克隆与一般的DNA片段的克隆有何异同点?

第六章作业:

1 Sanger双脱氧终止法化学降解法进行序列分析的原理是什么 ?

第七章作业:

1 DNA诱变种类有哪些,各有何特点?