Zápočet

1. Zápočet • Prezentace • Minimální počet bodů z testů – 23 • Kdo nemá • Přijde v zápočtovém týdnu ve středu v 9: 45 do této posluchárny a napíše si 1 až více testů z přednášek, na které test nepsal, nebo z těch, ze kterých má nejméně bodů • Kongresová hala, aula v 9:45 • 3 termíny • 22.1.2014 (středa) • 5.2.2014 (středa) • 18.2.2014 (úterý) Zkouška

2. Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22

3. Viry • Buněční parazité kompletně závislí na hostitelské buňce • Neexistuje aparát pro translaci, replikaci a pro tvorbu ATP • Virová částice (virion) obsahuje DNA nebo RNA a je obalena proteinovým kabátem (kapsida) • Being alive (virus) vs. living cells • DNA – genetická informace • RNA – poslíček • Ribozomy – translace • Proteiny – výroba ATP • Membrány – strukturní integrita

4. Morfologie viru • Kapsida (kapsidový protein – je kódován virem) • NK • Šroubovité vláknité viry • 5-10nm v průměru • Dlouhé až 1000nm • NK vázáná ze vnitř • Ikosaedrické viry • Dvacetistěn • Kapsida T1 - 60 molekul jednoho proteinu (2-5kb) • Kapsida T4 – 240 molekul (pojme přes 10kb) VIRION

5. Morfologie viru • Komplexní struktura • Kolem kapsidy ještě obal z napadené buňky (viry savčích buněk) • Pučí z membrány, do které byl zabalen virový protein • Bakteriofág • Ikosaedrická hlavička • Šroubovitý bičík • Vlákna • basální destička

6. Variabilita virového světa • Infikují bakteriální, rostlinné a živočišné buňky • Nejmenší virus má pouze 3 geny, nejkomplikovanější virus má 200-300 až 900 genů • Mimivirus • Největší známý virus • Isoheadrický, 0,75uM • 1,2Mbp genom, 900 genů • Bakteriofág G • Infikuje Bacillus megaterium • Obsahuje 700 genů

8. Variabilita virového světa 3‘ 5‘ • ssDNA/dsDNA nebo ssRNA/dsRNA viry • Lineární nebo cirkulární • Replikace pomocí otáčivé kružnice • u lineárních dojde k cirkularizaci DNA/RNA • Syntéza druhého vlákna u ssDNA/ssRNA virů • Replikační forma • RNA viry si kódují svou vlastní RNA polymerázu, reverzní RNA transkriptázu RNA- mRNA/RNA + DNA 5‘ 3‘

9. Virový genom • Minimálně 3 geny • Kapsidový • Pro průnik do buňky • replikační • Nejčastější velikost genomu je 8-20kb (6-15 genů) • 3 typy virů • RNA viry – replikují se RNA polymerázou • Retroviry – replikují se střídaním transkripce a reverzní transkripce • DNA viry – replikují se DNA polymerázou ssRNA viry, bakteriofágy, 3kb

10. RNA viry • Výhoda – RNA ihned připravena k translaci ( ne u minus RNA virů) • V cytoplasmě (vyhnou se jádru plného různých enzymů na úpravu RNA) • Nevýhoda • RNA polymerace pomocí RNA dependentní RNAP (nevyskytuje se v buňce) • Syntéza minus vlákna, které musí být odstraněno při sbalování do kapsidy • Nemohou si dovolit příliš velké genomy – chyba RNAP je 1/10kb • Maximální velikost genomu je 20kb • RNA dependetní RNAP se v buňce neyskytuje – nemohou se spoléhat na buněčný aparát • Chybějí ssRNA vazebné proteiny, helikáze atd

11. Replikační strategie RNA virů • Vlastní RNA dependentní RNA polymeráza • V cytoplasmě • Obvykle kódují 3-8 proteinů • Problémy: • Některé geny je třeba přeložit častěji než jiné • Polyproteinová strategie (autokatakytický sestřih vlastních proteinů) (picornaviry) • Ignorace stop kodónů a start kodónů • Subgenomová mRNA (alphaviry) • Virová mRNA je „přitažlivější“ pro ribozom než vlastní mRNA • Plus RNA musí mít čepičku již od bývalého hostitele • Minus RNA – dojde k replikaci ( k segmentaci) a k přidání čepičky (virová RNAP – 2000AA, polyfunkční) • Replikace virové RNA • RNAP • Fungují současně jako helikázy a SSB

12. Pozitivníss RNA viry • Picornaviry • Obrna, nachlazení, hepatitida A, kulhavka a slintavka • +RNA je využíváno k translaci (bezčepičková translace) • Má 3‘ poly A konec • 5‘ konec je chráněn proteinem Vpg nahrazující čepičku (nutný pro replikaci), pro translaci je důležitá sekvence 150 – 600bp poté • Viry kódují proteázu štěpící CBP faktor-vyřadí tím všechny buněčné mRNA • Je vytvářen polyprotein, který je následně naštípán na 10 – 20 proteinů

13. Replikace + ss RNA viru • The Alphavirus life cycle • Průnik do buňky endocytózou • Virový genom je vpuštěn do cytoplasmy • 1 nestrukturální polyprotein (nsPs) je přepsán • nsP1 – syntéza negativního vlákna • nsP2 – RNA helikáza, proteináza – zastavuje transkripci hostitele • nsP3 – replikáza • nsP4 – RNAP • 4. Syntéza celého minus vlákna • - templát pro syntézu subgenomické RNA • - polyprotein C-pE2-6K-E1 • - templát pro syntézu genomické RNA • 5. Sbalení virové částice a vypučení ven Biology and pathogenesis of chikungunya virus Olivier Schwartz & Matthew L. Albert

14. Negativníss RNA viry • Evolučně velmi mladá skupina virů • Velmi virulentní • Vzteklina, spalničky, příušnice, chřipka, Ebola etc. • Vnější membrána je odvozena od membrány hostitelské buňky • Musí si přinést svou RNAP • Genomová RNA má na svých koncích vždy invertované repetice 15 -20bp dlouhé • N-P-M-G-L geny (na + řetězci) • Protein N • povrch kapsidy • Anti-terminační účinky • Až 100x více než proteinu G Messenger RNA Cap Methylation in Vesicular Stomatitis Virus, a Prototype of Non‐Segmented Negative‐Sense RNA Virus Jianrong Li1, 2, 3 and Yu Zhang1

15. dsRNA viry • dsRNA viry • Poměrně vzácné • Asi 12 kusů dsRNA, každý kóduje jeden protein • Rotaviry • Replikační komplexy jsou uvnitř kapsidy

16. DNA viry • Vyvíjejí se v jádře buňce a využívají běžných buněčných mechanismů pro replikaci a transkripci • Většina DNA virů napadá obratlovce • Musí se vyrovnat se striktní kontrolou buněčného cyklu • Virus bývá schopen produktivní infekce jen za nepříznivých okolností a v omezeném spektru tkání • Většinou je infekce latentní Transformace buněk – oslabení kontroly buněčného cyklu směřující k neomezenému množení Začlenění DNA viru do genomické DNA

17. dsDNA viry • dsDNA viry baktérií • typický baktériofág • T4, lambda, P1, Mu • dsDNA viry vyšších organismů • Papaoviry (polyoma a papiloma) • Nejmenší dsDNA viry (5kb) • T-antigen • Protein ovlivňující buněnčný cyklus (vyvazuje p53 protein, vstup do S fáze) • Při dostatečném množství iniciuje replikace virového genomu • Latentní infekce vedou ke vzniku nádorů • Herpesvirus • Opar, sexuálně přenosný herpes, plané neštovice, mononukleózu • Největší jaderné DNA viry (150 – 230kb) • Obrovský arsenál vlastních proteinů • Latentní herpesviry

18. DNA viry • dsDNA viry vyšších organismů • Poxvirus • Velmi komplexní (150 – 200 genů) • viditelné pod světelným mikroskopem (0,4 -0,2 uM) • K replikace dochází v cytoplasmě buňky (jako jediný DNA virus) • V kapsidě má svou RNAP, 2-3 transkripční faktory, 3 enzymy pro syntézu a metylaci čepičky, DNA topoisomerazu, DNAP • dsDNA viry rostlin • Poměrně vzácné • CMV virus – cauliflower mosaic virus

19. Bakteriální virus - bakteriofág • Objeveny v roce 1917 • Phage – řecké slovo pro „ jíst“ • Využívány hojně v molekulární biologii • Bakteriofág  - nejvíce studovaný organismus • Pouze DNA/RNA vstupuje do buňky • 1952 – pokus s bakteriofágem ukazující, že DNA je nositelem genetické informace • Fágové – nejpočetnější skupina živé formy • 1030 baktérií, každá má 10 fágů • 1031 fágů • Mořská voda – 50x106 virů na 1 ml • Ničí 40% baktérií denně – koloběh uhlíku

20. Životní cyklus viru • Navázání se na buňku • Vstup do buňky • Vstupuje pouze DNA/RNA (rostlinné a bakteriální viry) • Vstupuje cely nukleokapsid (živočišné viry) • Replikace virového genomu • Výroba virových proteinů • Sbalení nových virových částic • Uvolnění z buňky

21. Životní cyklus viru • Vstup do buňky • Vstupuje pouze DNA/RNA (rostlinné a bakteriální viry) • Vstupuje cely nukleokapsid (živočišné viry)

22. Životní cyklus viru • Ranné geny • jejich promotory připomínají promotory hostitelské buňky • kódují proteiny důležité pro replikace • Pozdní geny • u některých virů jsou tyto geny přepisovány virovou RNA polymerázou • kódují proteiny kapsidy

23. Expresní strategie dsDNA fágů • 95% všech fágů • Proces infekce: • Časná fáze • Slabá transkripce časných genů bakteriální RNAP • Transkripční geny • Geny interferující s retričkním systémem baktérií • Proteiny zabraňující superinfekci • Střední fáze • Transkripce hlavních fágových replikačních proteinů • Pozdní fáze • Intesivní replikace fágové DNA • Silná exprese kapsidových proteinů

24. ssDNA viry baktérií • Bakteriofág X174 • 5386 bp, 11 genů • 5 genů se překrývá • Gen D a gen E • Gen D důležitý pro sbalení kapsidy • Gen E rozrušuje bakteriální stěnu a umožňuje uvolnění viru z buňky • Bakteriofág M13 • Dlouhé filamentum • Infikuje pouze F baktérie • M13 virus nezabíjí baktérie, používá se na přípravu ssDNA

25. Lytický vs latentní cyklus • Virus integrovaný do genomu – provirus, prophage • Integrace do genomu může být přes definovaná místa ( attachment site), nebo náhodná 20-40 minut 10 – 100 fágů Plak 4-10mm

27. Louis Pasteur ( 1822 – 1895) • Zakladatel moderni lékařské mikrobiologie • pasterizace/sterilizace • podpora teorie, že za nemocí stojí choroboplodné zárodky • První vakcinace za použití laboratorně oslabeného organismu (viru, či bakterie) • Vakcína proti anthrax a vzteklině

28. Eradikace neštovice • Edward Jenner (1749 – 1823) • Virus Variola major, V. minor • 20. století – 300-500 milion lidí umírá • 26.10. 1977 – poslední případ • 9.12. 1979 - eradikace • 1986 – konec očkování • 2 vzorky stále na světě (CDC, Atlanta a State Research Center for Virogology, Koltsovo, Russia) • Nebezpečí použití jako biologické zbraně

30. Vítězství nad obrnou • Jonas Salk (1914 – 1955) • virolog • Vakcína proti dětské obrně • Obrna patřila mezi nejobávanější nemoci poválečných let • 1952 – 58 000 případů obrny • 1954 – klinické testy, nejrozsáhlejší vůbec (1 800 000 dětí se účastnilo testů) • 12.4.1955 - vakcína funguje • 1962 – orální vakcína (Albert Sabin)

31. Mobilní elementy - transpozony • Mobilní DNA – dochází k přesunu DNA v rámci jedné DNA, nebo mezi DNA jádra • Skákající geny – proces je nazýván transpozice • Transpozony nejsou nikdy samostatně • Transpozony • DNA (cut and paste transpozice) • Retroposony (copy and paste transpozice) • Způsoby transpozice • Konzervativní (cut and paste) • Replikativní (copy and paste)

32. DNA transpozon • Inerzní repetice na svých koncích • 9-40 bází • ORF 1kb – transponáza • Frekvence transpozice je 1/1000 až 1/10000 na 1 transpozon na buňku • Cílová sekvence – rozpoznávána transponázou • 3-9bp • Transponózy nesou geny pro resistenci na antibiotika, virulentní geny, metabolické geny

33. Cut and paste transpozice • Nereplikativní, konzervativní

34. Replikativní transpozice • Více komplexní transpozice • Resolváza rozeznáva interní místo • Částečně palindromická sekvence 30-40bp • Dochází k replikaci transponózu

35. Bakteriální transpozony • Nejjednodušší transpozóny • Inserční sekvence – IS • IS1, IS2 atd. • 750 – 1500 bp dlouhé, repetitivní konce jsou 10 – 40bp • Pouze cut-paste transpozice • Regulovaná transpozice pomocí regulačního proteinu A • Neregulovaná transpozice by vedla ke zničení chromozómu • F-plasmid obsahue IS2 a IS3 - transpozice

36. Regulace transpozice Tn10 • Bakteriální transpozón • Kompozitní transpozón nesoucí gen pro resistenci na tetracyklin • Transpozice nereplikativním způsobem • Transpozice je silně regulována • Antisense RNA (transript z Pout se překrývá s Pin • Mutace transponázy v IS1 OL • Transpozice je inhibován dam methylací (GATC sekvence promotoru transponázy, k transpozici docházi v pouze momentě replikace, kdy DNA není methylována) Transponáza zmutovaná 1-10% aktivity Transponáza plně funkční

37. Bakteriofág Mu • Virus vs transpozón • Genom 38kb • Po infekci se integruje do genomu pomocí nereplikativní transpozice • Promotory replikačních genů jsou zareprimovány represorem • Fág je stabilní a nepřesouvá se • Vhodný podnět (SOS reakce) – ranný promotor se odblokuje, nastane silná replikativní transpozice, přemístí si až 100x • Odblokuje se i pozdní promotor – syntéza kapsidových proteinů

38. Transposony vyšších organismů • Barbara McClintock (1951) • Ac/Ds rodina transpozonů • Ac – aktivátor • Ds - disociátor • Repetitivní konce 11 bazí • Cílová sekvence – 8bp • Ac element je 4500bp, plně funkční • Ds element je defektni Ac element

39. Další typy DNA transpozónů • P elements – Drosophilla melanogaster • M kmen – v laboratoři od 1905 • P kmen – v přírodě • Křížením M kmene (samice) a P kmene (samce) – sterilní potmostvo • V M kmenech v somatických buňkách se translatuje represor • Tc1/Mariner like transpons – všude, nejběžbější typ transpozónu • Sleeping beauty transpozon (usnul před 10-15 milióny let) • Transpozóny obratlovců jsou většinou zmutaované a nefunkční • Zrekonruován původní transpozón – velmi aktivní • „virulence“ transpozónů klesá v průběhu evoluce

40. RNA transpozóny - retroposony • Původní RNA transkripce, která se reverzní transkripcí změnila na DNA a integrovala do chromozómů • Po transkripci své DNA jsou schopni transpozice – kódují si vlastní RT • Retroposon je transpozon, který je mobilizovaný ve formě RNA, která musí být přepsána do cDNA • Transponová RNA kje v jádře volná a tudíž umožňuje transpozici do vzdálených míst • Musí kódovat transponázu • Musí kódovat RT • Případně proteiny chránící před všudepřítomnými Rnázami • Proteiny, které umí zabalit RNA a chránit ji retroviry • Virová (LTR) nadrodina • Nevirová (non LTR) nadrodina • U rostlin a živočichů představují až 50% genomu

41. Retroviry • Vir obsahuje ssRNA (pozitivní) • Především u ptáků a savců • V hostitelské buňce může být integrován do DNA • Reverzní transkriptáza • Nejpůvodnější a nejprimitivbější • Je velmi pomalá a chybující, bez korektury • Templát je okamžitě degradován (Rnase H aktivita) • LTR – long terminal repeats • Jde proti centrálnímu dogma molekulární biologie

42. Replikační cyklus retroviru integráza Nikdy nedochází k translace retrovirové RNA Virus si přináší reverzní transkriptázu Integrázu tRNA Reverzní transkriptáza

43. Genom retroviru • Gag – kapsidové proteiny • Matrixový • Kapsidový • Nukleokapsidový – váže virovou RNA • Pol – enzymy • Proteáza • Reverzní transkriptáza • integráza • Env – obalové proteiny • povrchový protein • Transmembránový protein Unikátní U5 sekvence + PBS sekvence Silný promotor v U3 oblasti Pouze jeden – retrovirus kombinuje strategii subgenomových mRNA s polyproteinovou

44. Replikace retrovirů RNA DNA PBS sekvence Spárování Strong stop minus DNA Dlouhý usek pyrimidinů, který není schopna RT rozštípat

46. LTR retroposony • Velmi podobné retrovirům, jen nemají (ztratili, nebo ještě nezískali) ORF pro env • Ty elementy kvasinky • Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 a Ty5 • Jejich transkripty představují as 5% veškeré mRNA v buňce • ~6.3 kb, 330 dlouhé LTR • Frekvence transpozice 10-7 az 10-8 • Copia elementyD. melanogaster • ~5000bp, 276 dlouhé LTR • 20 – 60 kopií na buňku • Frekvence transpozice 10-3az 10-4

47. Non LTR retroposony • Nevirové • Sestřihové pseudogeny • Úseký, odpovídající cDNA kopii transkriptu RNA (někeré mají dokonce poly A/T) • Nejsou funkční • nejsou hojné (pouze 0,5% genomu člověka) • LINES – long interspersed nuclear sequences • SINES – short interspersed nuclear sequences

48. LINES • Genomové cDNA kopie transkriptů RNAP II a III • Jsou velmi hojné, velmi příbuzné • K transpozici L1 dojde u 10 z 250 lidí (pouze v zárodečné linii) • 2 ORF • RNA vazebný protein • RT s nukleázou

49. SINES • cDNA kopie transkriptů RNAP III • Až milióny kopií v genomu • Tvoří významnou část repetitivní DNAjsou náhodně roztroušené • Nejznámější tzv. Alu sekvecne (300bp) • Replikace a integrace LINES a SINES

50. Význam transpozónů v lidském genomu