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基因组与比较基因组学

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基因组与比较基因组学. 20 世纪人类科技发展史上的三大创举. 90 年代人类基因组计划. 60 年代人类首次登上月球. 40 年代第一颗原子弹爆炸. Contents in this chapter. 人类基因组计划 DNA的鸟枪法序列分析技术 比较基因组学及功能基因组研究. 一、人类基因组计划. 1. 人类基因组计划的启动 1986 年诺贝尔奖获得者 R.Dulbecco (杜尔贝科)提出人类基因组计划 —— 测出人类全套基因组的 DNA 碱基序列( 3 × 10 9 bp ). 1975 年,获诺贝尔生理医学奖.

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20世纪人类科技发展史上的三大创举

90年代人类基因组计划

60年代人类首次登上月球

40年代第一颗原子弹爆炸

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Contents in this chapter

  • 人类基因组计划
  • DNA的鸟枪法序列分析技术
  • 比较基因组学及功能基因组研究
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一、人类基因组计划

1.人类基因组计划的启动1986 年诺贝尔奖获得者R.Dulbecco(杜尔贝科)提出人类基因组计划——

测出人类全套基因组的 DNA 碱基序列( 3 × 109 bp )

1990 hgp 15 30 hgp hgp 1993
美国政府决定于 1990年正式启动HGP,预计用15 年时间,投入30 亿美元,完成 HGP。由国立卫生研究院和能源部共同组成“人类基因组研究所”逐渐地,HGP 扩展为多国协作计划。参与者包括:英、日、法、德和中国(1993年)
2 1 1998 10 1 8 10 8 bp 6 2
2.人类基因组计划的进展状况(1)截至 1998 年 10 月,完成 1.8× 108bp,占 计划的 6%。(2)完成一系列模式生物全基因组测定。 这些模式生物全基因组测定的完成有重大理论与现实意义。
3 dna 1998 5 9 j c venter 3 3
(3)DNA 测序技术飞速提高1998.5.9J.C. Venter 等宣布,组建商业公司,投入 3 亿美元,3 年内完成。

接着又有若干家公司成立,总共投入资金约几十亿美元,

形成“公”“私”并进格局

2000.6完成并公布人类基因组工作框架图( 90%)。

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二000年六月二十六日克林顿宣布

人类基因组草图绘制完成

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美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯·柯林斯在介绍情况。美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯·柯林斯在介绍情况。
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人类蛋白质

  • 61%与果蝇同源
  • 43%与线虫同源
  • 46%与酵母同源
人类基因组草图基本信息
  • 由31.65亿bp组成
  • 含3-3.5万基因
  • 与蛋白质合成有关

的基因占2%

人类基因组

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2000 年 12 月美、英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱,这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。

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2001 年2月16日人类基因组“精细图”完成(99%)

同时发表论文:美国Science, Vol. 291, No. 5507 ;英国Nature , Vol.409, p.860

2003年4月14日,人类基因组序列图亦称“完成图”(99.99%),提前绘制成功。

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基因及基因组研究大事记:

1860至1870年奥地利科学家孟德尔根据豌豆杂交实验提出遗传因子概念,并总结出孟德尔遗传定律。

1909年丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”这一名词,用以表达孟德尔的遗传因子概念。

1944年3位美国科学家分离出细菌的DNA(脱氧核糖核酸),并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。

1953年美国人沃森(Watson)和英国人克里克(Crick)通过实验提出了DNA分子的双螺旋模型。

1969年科学家成功分离了第一个基因。

1990年10月被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。

1998年一批科学家在美国罗克威尔(Rockville)组建塞莱拉遗传公司,与国际人类基因组计划展开竞争。

1998年12月一种小线虫完整基因组序列的测定工作宣告完成,这是科学家第一次绘出多细胞动物的基因组图谱。

1999年9月中国获准加入人类基因组计划,负责测定人类基因组全部序列的1%。中国是继美、英、日、德、法之后第6个国际人类基因组计划参与过,也是参与这一计划的唯一发展中国家。

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1999年12月1日国际人类基因组计划联合研究小组宣告,完整破译出人体第22对染色体的遗传密码,这是人类首次成功地完成人体染色体完整基因序列的测定。1999年12月1日国际人类基因组计划联合研究小组宣告,完整破译出人体第22对染色体的遗传密码,这是人类首次成功地完成人体染色体完整基因序列的测定。

2000年4月6日美国塞莱拉公司宣布破译出一名实验者的完整密码,但遭到不少科学家的质疑。

2000年4月底中国科学家按照国际人类基因组计划的部署,完成了1%人类基因组的工作框架图。

2000年5月8日德、日等国科学家宣布,已基本完成了人体第21对染色体的测序工作。

2000年6月26日科学家公布人类基因组工作草图,标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要一步。

2000年12月14日美英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱。这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。

2001年2月12日中、美、日、德、法、英6国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。 科学家首次公布人类基因组草图“基本信息”。

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3.人类基因组计划的科学意义

(1)确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置,研究基因的产物及其功能。

(2)了解转录和剪接调控元件的结构与位置,从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。

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(3)从整体上了解染色体结构,包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织,了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。(3)从整体上了解染色体结构,包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织,了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。

(4)研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看,似乎相距甚远,但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置,因此,有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。

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(5)发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性,正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育,因此,了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化,将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。(5)发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性,正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育,因此,了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化,将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。
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(6)研究DNA突变、重排和染色体断裂等,了解疾病的分子机制,包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程,为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。(6)研究DNA突变、重排和染色体断裂等,了解疾病的分子机制,包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程,为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。

(7)确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列,研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响,可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。

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(8)研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外,这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。(8)研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外,这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。
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遗传图谱

转录图谱

0.7 cM 或 kb

序列图谱

物理图谱

100 kb

STS map

4.HGP的主要任务

四张图:

物理图、 转录图

遗传图 、序列图

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4.1 遗传图(连锁图)

指基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离。cM(基因或DAN片段在染色体交换过程中分离的频率)

cM越大,两者之间距离越远。确定了解各个基因之间的相对距离与方向。  

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遗传距离是通过遗传连锁分析获得的,研究中所使用的DNA标志越多,越密集,所得到的遗传连锁图的分辨率就越高。遗传距离是通过遗传连锁分析获得的,研究中所使用的DNA标志越多,越密集,所得到的遗传连锁图的分辨率就越高。
  • 经典的遗传标记是可被电泳或免疫技术检出的蛋白质标记,如红细胞ABO血型位点标记,白细胞HLA位点标记等。
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例如,在ABO血型基因中,位于9号染色体长臂3区4带(9q34)的基因IA,决定抗原A的存在,表现A型血性状。由于ABO血型的广泛存在,所以可用它作遗传标记。

当在某一家庭中,观察到了指甲髌骨综合征与A型血相伴遗传时,认为,这种病的致病基因NP与IA基因相连锁,也位于9q34区段。进一步的观察发现,这个家庭的后代中,有1/10为A型血而无指甲髌骨综合征,这表明基因IA和NP发生了交换,交换率(重组率)为1/10。这时就可说,基因IA和NP相距较近,连锁图上的距离为10厘摩(重组率1%即为1厘摩)。

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标签

表现型

筛选方法

ADE2

培养基中需加入腺苷酸

只能在加入腺苷酸的培养基上生长

CAN1

对刀豆氨酸有抗性

能在含有刀豆氨酸的培养基上生长

CUP1

对铜离子有抗性

能在含有铜离子的培养基上生长

CYH1

对环己酰亚胺有抗性

能在含有环己酰亚胺的培养基上生长

LEU2

培养基中需加入亮氨酸

只能在加入亮氨酸的培养基上生长

SUC2

能进行蔗糖发酵

能在以蔗糖作为唯一碳源的培养基上生长

URA3

培养基中需加入尿嘧啶

只能在加入尿嘧啶的培养基上生长

酵母遗传分析中最常用的生物化学标签

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如果只用已知定位的少数几个基因作遗传标记,由于遗传标记的数目太少,很难绘制完整的连锁图。DNA技术的建立为人类提供了大量新的遗传标记。如果只用已知定位的少数几个基因作遗传标记,由于遗传标记的数目太少,很难绘制完整的连锁图。DNA技术的建立为人类提供了大量新的遗传标记。
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多态性:人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异(variation),并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代,从而在不同个体间表现出不同,因而被称为多态性(Polymorphism)。多态性:人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异(variation),并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代,从而在不同个体间表现出不同,因而被称为多态性(Polymorphism)。
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第一代DNA遗传标记是RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性片段长度多态性)。

DNA序列上的微小变化,甚至1个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生,导致酶切片段长度的变化。由于核苷酸序列的改变遍及整个基因组,特别是进化中选择压力不是很大的非编码序列之中,RFLP的出现频率远远超过了经典的蛋白质多态性。而且,只要选择得当,生物体内出现共显性RFLP及RAPD分子标记的频率较高。

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第二代多态性标记是短的串联重复序列

包括小卫星DNA和微卫星DNA,其多态性主要来自重复序列拷贝数的变化

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小卫星DNA—由15-65bp的基本单位串联重复而成,长度一般不超过20kb。小卫星DNA—由15-65bp的基本单位串联重复而成,长度一般不超过20kb。

重复次数(小卫星DNA区的长度)在人群中是高度变异的;按照孟德尔的规律遗传

微卫星DNA/简短串联重复(STR、STRP或SSLP)

重复单元2-8bp,通常重复10-60次

CTAGCTTATATATATATATATATATATATAAGCTTGC

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第三代多态性标记是单核苷酸的多态性

(single nucleotide polymorphism,SNP)

可能也是最好的遗传标记,是分散于基因组中的单个碱基的差异。这种差异包括单个碱基的缺失和插入,但更常见的是单个核苷酸的替换,

SNP:是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。

第一军医大学2003年分子生物学

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SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于,它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记。SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于,它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记。

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“遗传图”的建立为人类疾病相关基因的分离克隆奠定了基础。拥有5000多个遗传学位点,相当于把整个人类基因组划分为5000多个小区,并分别设置了“标牌”。这些标牌将在搜索功能基因的过程中发挥独特的作用。“遗传图”的建立为人类疾病相关基因的分离克隆奠定了基础。拥有5000多个遗传学位点,相当于把整个人类基因组划分为5000多个小区,并分别设置了“标牌”。这些标牌将在搜索功能基因的过程中发挥独特的作用。
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4.2 物理图

以已知核苷酸序列的DNA片段(序列标签位点,sequence-tagged site,STS)为“路标”,以碱基对作为基本测量单位(图距)的基因组图。

遗传图所表现的,是通过连锁分析确定的各基因间的相对位置;物理图则表现染色体上每个DNA片段的实际顺序。

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酵母第三号染色体遗传图(右)和物理图(左)的比较酵母第三号染色体遗传图(右)和物理图(左)的比较

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现在的测序技术还不能对整个DNA分子进行序列测定,因此须先将它切成一个个大小不同的片段,然后将这些片段连起来,构成连续的序列。现在的测序技术还不能对整个DNA分子进行序列测定,因此须先将它切成一个个大小不同的片段,然后将这些片段连起来,构成连续的序列。

这些大片段在进行DNA分子克隆时,用一种特殊的载体--酵母人工染色体(YAC),将片段导入酵母,在酵母细胞中克隆。YAC中的DNA大片段是靠序列标记位标(STS)来识别的。STS是一段200~500碱基对的已知序列,在染色体上有一定的位置,所以用STS作位标可将不同YAC克隆排列成邻接克隆群(contig)。  其他载体还有BAC(细菌人工染色体)、P1(噬菌体人工染色体)、粘粒(cosmid)、细菌质粒等。现在,人类基因组24条染色体的YAC、BAC、P1邻接克隆群均已建立,精度约100碱基对的物理图也基本绘成,并已开始进行大规模测序。

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4.3 转录图

以EST(expressed sequence tag ,表达序列标签)为标记,根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。

EST:通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5'或3'端序列称为表达序列标签(EST),一般长300-500bp左右。

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所有蛋白质都是由mRNA(信使核糖核酸)编码的,而mRNA又由DNA转录而来。人类基因组中仅1%~5%的DNA是编码序列(基因);成人各种组织中又只有约10%的基因表达为蛋白质。所有蛋白质都是由mRNA(信使核糖核酸)编码的,而mRNA又由DNA转录而来。人类基因组中仅1%~5%的DNA是编码序列(基因);成人各种组织中又只有约10%的基因表达为蛋白质。
  • 所以,建立转录图,或从mRNA逆转录而来的cDNA图,是分离、定位和克隆基因的关键。
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EST可用工业化的程序生产,只要分离到某一发育阶段某一组织的mRNA,就可用逆转录法,从mRNA合成相应的cDNA片段,即EST。

用它作探针,就可从基因组文库中筛到全长的基因序列。

截止到1998年2月,已发现约92万条EST,转录图的制作有了良好的开端,但这已属后基因组计划的工作。

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4.4 序列图(分子水平的物理图)

序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图,也是最详尽的物理图。

既包括可转录序列,也包括非转录序列,是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。

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二、DNA的鸟枪法序列分析技术

1.DNA的鸟枪法测序原理

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1999 年 12

月用“逐个克隆法”获得第一条人类染色体 —22号染色体完成序列

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2000 年3 月用“全基因组鸟枪法”获得果蝇全基因组序列。

2 dna
2.DNA的鸟枪法测序的主要步骤
  • 第一,建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。
  • 第二,高效、大规模的末端测序。
  • 第三,序列集合。
  • 第四,填补缺口。
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3.DNA的鸟枪法测序的优缺点

优点:速度快

缺点:

●随着所测基因组总量增大,所需测序的片段大量增加

●高等真核生物(如人类)基因组中有大量重复序列,导致判断失误

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对鸟枪法的改进(1) Clone contig法。首先用稀有内切酶把待测基因组降解为数百kb以上的片段,再分别测序。(2) 靶标鸟枪法(direted shotgun)。首先根据染色体上已知基因和标记的位置来确定部分DNA片段的相对位置,再逐步缩小各片段之间的缺口。

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三、比较基因组学及功能基因组学研究

1.比较基因组学(Comparative Genomics)

概念:是基于基因组图谱和测序基础上,对已知的基因和基因组结构进行比较,来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。

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2.功能基因组学研究

2.1 概念:利用结构基因组学提供的信息,以高通量,大规模实验方法及统计与计算机分析为特征,全面系统地分析全部基因的功能。

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2.2. 基因功能的研究方法

(1) 基因转导技术:导入细胞,观察功能。该方法用的最多,技术最成熟。

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(2)基因敲除技术(gene knockout)

又称基因打靶(gene targeting)。这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除,或用其他序列相近的基因取代(又称基因敲入),然后从整体观察实验动物,从而推测相应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。