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Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora , agents de la rouille foliaire des peupliers

Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora , agents de la rouille foliaire des peupliers. INRA Nancy Unité de recherche Pathologie Forestière. Claude Husson , Pascal Frey, Jean Pinon. moins de 1 000 ha. de 1 000 à 2 500 ha. de 2 500 à 5 000 ha. plus de 5 000 ha.

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Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora , agents de la rouille foliaire des peupliers

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  1. Deux méthodes de diagnostic moléculairedes espèces de Melampsora,agents de la rouille foliaire des peupliers INRA Nancy Unité de recherche Pathologie Forestière Claude Husson, Pascal Frey, Jean Pinon

  2. moins de 1 000 ha de 1 000 à 2 500 ha de 2 500 à 5 000 ha plus de 5 000 ha Les peupleraies 230 000 ha 1,3% de la surface boisée 2,2 millions m3 par an ( chêne) culture clonale : monoclonale / parcelle pauciclonale / région

  3. urédospores urédies Pertes économiques importantes La rouille foliaire des peupliers Agents pathogènes : Melampsora spp. (Basidiomycètes, Urédinales) Dégâts: • défeuillaison intense • réduction de croissance • affaiblissement général

  4. M. larici-populina,la plus fréquente et la plus agressive M. allii-populina, présente partout en France M. medusae, parasite de quarantaine, essentiellement dans leSud-Ouest de la France Nord+Est Centre Ouest Sud-Ouest En France, 3 espèces de Melampsora sont pathogènes sur les peupliers cultivés :

  5. 1 cm 1 cm 1 mm urédies écidies hôte alternant (mélèze) hôte principal (peuplier) télies • télien • écidien  morphologie très proche entre espèces morphologie distincte entre espèces détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire  • urédien Cycle de la rouille du peuplier Identification des espèces à différents stades de développement :

  6. M. larici-populina (30 isolats) M. larici-populina M. allii-populina (28 isolats) 88 isolats étudiés M. allii-populina M. medusae (30 isolats) M. medusae M. medusae Origine géographique des isolats étudiés

  7. Région ITS (Internal Transcribed Spacer) de l’ADN ribosomal I - Analyse de la formation d’hétéroduplex M. larici-populina M. allii-populina M. medusae II - Trois couples d’amorces spécifiques des espèces : 100 pb 5,8S ITS2 25S 17S ITS1 ITS4-MLP ITS4-MAP ITS4-MM ITS1-MLP ITS1-MM ITS1 ITS4 ITS1-MAP Les deux outils de biologie moléculaire utilisés

  8. Espèce à déterminer ITS amplifiés (amorces ITS1 / ITS4) 3 ITS de référence M. medusae M. larici-populina M. allii-populina dénaturation à 94°C renaturation jusqu’à 25°C homoduplex et hétéroduplex homoduplex et hétéroduplex I - Analyse par formation d’hétéroduplex :PRINCIPE homoduplex

  9. Révélation sur gel d’acrylamide à 8% M : marqueur de taille (100 pb) MLP : M. larici-populina MAP : M. allii-populina MM : M. medusae MLP + MM MAP + MAP MLP + MAP MLP + MLP MM + MM MAP + MM M hétéroduplex  700 pb Révélation sur gel d’agarose à 1% MLP + MM MAP + MAP MLP + MAP MLP + MLP MM + MM MAP + MM M hétéroduplex  homoduplex I - Analyse par formation d’hétéroduplex : MISE EN EVIDENCE homoduplex

  10. CONCLUSIONS : • méthode moléculaire simple et fiable pour l’identification des espèces I - Analyse par formation d’hétéroduplex RESULTATS : Confrontations des ITS amplifiés des urédospores des 88 isolats avec les 3 ITS de référence • Formation d’hétéroduplex dans 100% des confrontations interspécifiques (ITS hétérologues) •  Absence d’hétéroduplex dans 100% des confrontations intraspécifiques • (ITS homologues) • gel d’agarose bien adapté au diagnostic interspécifique en routine • méthode indirecte d’analyse du polymorphisme de séquence • pourcentage d’homologie intraspécifique des ITS supérieur à 95%

  11. M. larici- populina M. allii- populina M. medusae ITS1-MLP / ITS4-MLP Validation sur l’ADN d’urédospores de 88 isolats : M 1 8 9 T 4 5 6 7 2 3 • Les couples d’amorces spécifiques d’espèce permettent l’amplification de l’ADN de 100% des isolats de l’espèce correspondante ITS1-MAP / ITS4-MAP La spécificité des amorces est confirmée Outil d’identification des 3 espèces de Melampsora très fiable ITS1-MM / ITS4-MM ITS1 / ITS4 II - Amorces spécifiques d’espèces : RESULTATS ET CONCLUSIONS • Aucune réaction croisée entre ces 3 espèces n’a été observée

  12. cas de M. larici-populina : télies sur peuplier écidies sur mélèze II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 1- identification d’une espèce à différents stades du développement • Validation du couple d’amorces sur ces deux stades • Pas de réaction croisée avec l’ADN de l’hôte

  13. II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2 - détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire au stade urédien (peuplier) : cas de M. medusae en mélange avec M. larici-populina • M. medusae - parasite de quarantaine - espèce peu fréquente - répartition géographique mal expliquée : Sud-Ouest de la France • M. larici-populina - espèce très majoritaire en France

  14. [ ADN M. medusae ] 600 pb    Détection de M. medusae dans une solution à 0,1 pg / µl 0,5 pg/µl 10 pg/µl 0,1 pg/µl 0,05 pg/µl 1 pg/µl 10 ng/µl 0,1 ng/µl 1 ng/µl T M II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges d’ADN de M. medusae et de M. larici-populina (10 ng/µl) utilisation des amorces spécifiques de M. medusae  Seuil de détection de 1 / 100 000 soit l’équivalent de la quantité d’ADN de 6 urédospores dans le mélange

  15. Dilution en cascade Nombre de spores de M. medusae 64000 6400 640 64 6 3 0 600 pb    Détection de 6 urédospores de M. medusae parmi 800 000 urédospores de M. larici-populina II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges de SPORES de M. medusae et de M. larici-populina (extraction de 2 mg de chaque mélange = 800 000 spores)  Seuil de détection inférieur à 1 / 100 000  Possibilité de détecter une seule urédie de M. medusae sur 100 feuilles de peuplier très infectées par M. larici-populina

  16. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Les amorces spécifiques d’espèces ont montré leur efficacité :  pour l’identification de l’espèce quel que soit le stade de développement  identification des espèces sur écidies : efficacité du passage de M. larici-populina sur mélèze  la détection d’une espèce rare (amorces >>>> microscope)  application pour le contrôle du parasite de quarantaine M. medusae, effectué par le LNPV Construction d’amorces spécifiques des 5 espèces de Melampsora des trembles :  certaines ont pour hôte altenant le mélèze  l’identification au microscope est très difficile, même au stade urédien

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