TECNICHE DI ESTRAZIONE SELETTIVA DI ANTOCIANI DALLE BUCCE D’UVA DI TIPO MERLOT

1. TECNICHE DI ESTRAZIONE SELETTIVA DI ANTOCIANI DALLE BUCCE D’UVA DI TIPO MERLOT A cura di Andrea Rabufetti 4H e Marco Servalli 4G Lavoro di maturità in chimica Anno scolastico 2004-2005 Liceo Cantonale di Lugano 2, Savosa

2. Nell’ultimo ventennio sono state esaltate le proprietà salutari legate ad un consumo regolare e moderato di vino soprattutto rosso. L’esigenza dei produttori di vino merlot del Ticino di origine controllata (Marchio Viti), di ottenere per quest’ultimo un colore più intenso. L’IDEA

3. Le proprietà salutari derivano dai pigmenti delle bucce d’uva: gli antociani. La colorazione del vino è data dagli stessi antociani durante il processo di vinificazione. Dopo il processo di vinificazione, le bucce rimangono ancora molto colorate e contengono perciò ancora numerosi antociani. Estraendo i pigmenti dalle bucce provenienti dalla vinificazione si potrebbe poi reinserirli nel vino.

4. DUPLICE VANTAGGIO • Proprietà antiossidanti del vino incrementate • Colorazione del vino incrementata

5. PROBLEMATICA • Estrarre in modo selettivo i pigmenti dalle bucce d’uva; • Per legge i pigmenti estratti possono essere inseriti solo nel vino proveniente dallo stesso lotto delle bucce dalle quali è avvenuta l’estrazione; • Non bisogna alterare le caratteristiche del vino dopo l’inserimento dell’estratto; • Una pratica del genere non è stata finora mai applicata; • Per cui deve essere conforme alla Ordinanza sulle derrate alimentari;

6. OBIETTIVI DELLA RICERCA • Trovare una tecnica adeguata di estrazione selettiva e possibilmente totale degli antociani rimasti nelle bucce d’uva. • Tutto questo evitando di compromettere la naturalezza dell’estratto. • Rendere utilizzabili l’estratto, a livello artigianale e industriale, per migliorare il colore e le proprietà salutari del vino rosso ottenuto dalla stessa materia prima che ha generato le bucce residue.

7. VINO E SALUTE Le proprietà salutari del vino derivano dall’uva con cui viene prodotto • Le sostanze più salutari contenute nell’uva e quindi nel vino sono i polifenoli, della cui categoria fanno parte i flavonoidi, che si suddividono in: • Antociani • Antocianine • Antocianidine • Proantocianidine • Tannini

8. VINO E SALUTE I polifenoli sono sostanze antiossidanti: captano e neutralizzano sostanze ossidanti e radicali liberi (OH°, O2-, H2O2) Prevengono o per lo meno riducono il rischio di malattie cardiovascolari e possono contenere l’incidenza di malattie croniche, quali il cancro, l’arteriosclerosi, il diabete, l’invecchiamento, le degenerazioni articolari e del tessuto connettivo.

9. L’abuso di alcol genera per contro uno stress ossidativo con elevata produzione di radicali, per questo non sempre il vino viene visto di buon occhio: ci sono altri alimenti come il tè e le cipolle che contengono quantità di polifenoli molto maggiori. VINO E SALUTE Per questo si consiglia un consumo moderato e regolare di vino durante i pasti (2-3 bicchieri), in quanto efficiente veicolo di antiossidanti,

10. POLIFENOLI NEL VINO COLORE nei vini rossi - antociani 200 – 500 mg/l ed in parte tannini nei vini bianchi - leucoantociani e tannini 15 – 20 mg/l - a volte clorofilla GUSTO astringenza (tanninI) -nei vini rossi 1- 3 g - nei vini bianchi 20 – 50 mg • Per quanto riguarda gli antociani: • il vino rosso ne contiene una quantità 20 volte superiore al vino bianco; • non possiedono né gusto né profumo, agiscono quindi esclusivamente sul colore!

11. CHIMICA DEGLI ANTOCIANI Antociani Pigmenti azzurri, rossi o violetti che si trovano nei fiori e nelle bucce d’uva (dal greco antos = fiore e cianos = azzurro). Sono chimicamente legati a zuccheri e hanno la caratteristica di cambiare colore e struttura molecolare secondo il pH i cui sono immersi. Possiedono proprietà antiossidanti e sono fondamentali per l’alimentazione umana. Formula di struttura di un antociano

12. STATO DELL’ARTE • L’estrazione massiccia e selettiva di antociani (enocianina), avviene tuttora a livello industriale con l’ausilio di anidride solforosa: si può schematizzare un procedimento di estrazione dell’enocianina nelle seguenti fasi: • Macerazione delle vinacce in SO2; • Riposo e defecazione; • Concentrazione con recupero o meno dell’alcole. Secondo questo metodo un’estrazione con resa soddisfacente è possibile solo da uve che sono particolarmente ricche di enocianina e altri antociani, da considerarsi però estranee alle uve Merlot. La legislazione svizzera non permette l’aggiunta e l’utilizzo di estratti da uve estranee. Un’estrazione industriale richiede quantità di uva elevate, che sicuramente i piccoli produttori di vino non avrebbero a disposizione.

13. METODO DI LAVORO • L’importanza della ricerca in letteratura Risparmio di tempo e possibilità di avere basi e spunti per il lavoro • Il metodo scientifico • Ipotesi • Verifica in modo sperimentale • Risultati • Conclusioni Il lavoro segue una logica consequenziale e lineare, basandosi su dati sperimentali

14. Step 1. Indagine preliminare sulla solubilizzazione degli antociani Obiettivo Ottenere informazioni sulla solubilità degli antociani in vari solventi SVILUPPO DEL LAVORO 2. Verifica della estraibilità mediante metanolo Verificare la capacità di estrazione del metanolo 3. Prova di estrazione mediante bagno a ultrasuoni Verificare se gli ultrasuoni possiedono proprietà ausiliario-estrattive 4. Prove di estrazione con CO2 supercritica e aggiunta di SO2 Verificare il potere estrattivo della SO2 in fase supercritica

15. 1. INDAGINE PRELIMINARE SULLA SOLUBILIZZAZIONE DEGLI ANTOCIANI • L’importanza della fermentazione Le bucce d’uva prima di essere sottoposte ad estrazione, vanno fermentate! Zuccheri liberi Alcol etilico Gli zuccheri liberi ostacolano le estrazioni !

16. Gli elettroni si spostano parzialmente verso l’atomo più elettronegativo - - + + SI FORMA UN LEGAME Acqua (H2O) LA POLARITÀ ATOMO Nucleo + Elettroni Idrogeno Ossigeno TRA DUE ATOMI ABBASTANZA VICINI La carica negativa non è uniforme sulla molecola !

17. PROCEDIMENTO Campioni di bucce fermentate vengono messi a contatto con solventi a polarità diversa. SOLUBILITÀ IL SIMILE SCIOGLIE IL SIMILE POLARE con POLARE, APOLARE con APOLARE RISULTATI E CONCLUSIONI Gli antociani sono molecole piuttosto polari: Il metanolo (alcol metilico) si è rivelato il solvente migliore: anche se è tossico si può eliminare facilmente con una distillazione.

18. 2. VERIFICA DELL’ESTRAIBILITÀ MEDIANTE METANOLO • Estrazione Soxhlet • PROCEDIMENTO • Bucce fermentate vengono sottoposte ad estrazione Soxhlet con metanolo. RISULTATI Le bucce sono poco decolorate, in compenso l’estratto ha tonalità molto intense.

19. Concentrazione dell’estratto • PROCEDIMENTO • L’estratto del Soxhlet viene sottoposto a distillazione per far evaporare tutto il metanolo. RISULTATI Si ottiene un concentrato solido di natura pastosa e colorazione marrone scura (tipico degli antociani). Tuttavia la consistente massa ottenuta non convince. • Degustazione • PROCEDIMENTO Un campione di estratto concentrato viene degustato. • RISULTATI Il campione presenta un gusto amaro e astringente tipico dei tannini.

20. Analisi cromatografica • PROCEDIMENTO Un campione di estratto viene sciolto in metanolo e poi depositato sulla piastra cromatografica che viene immersa nell’eluente. In seguito si analizza sotto raggi UV. RISULTATI L’analisi cromatografica rileva una debolissima concentrazione di antociani nell’estratto rispetto a quanto mostrato nel protocollo in letteratura. Risultati ottenuti e protocollo a confronto

21. Prove di solubilità e colorazione in vino • PROCEDIMENTO L’estratto viene sciolto in una soluzione di etanolo al 10% a pH3 e in seguito in vino ottenuto dalla fermentazione delle bucce d’uva. Si osserva poi la colorazione di quest’ultimo. RISULTATI L’estratto presenta una pessima solubilità nella soluzione di etanolo al 10% a pH, inoltre la colorazione è pessima: verde marcio. La solubilità in vino sembra migliorare. Comunque la colorazione prodotta è deludente: dopo aver allungato con 20 ml di acqua la miscela vino-estratto (provetta centrale), si nota che questa risulta più chiara rispetto al vino stesso (provetta di destra).

22. CONCLUSIONI Il metanolo non si è dimostrato per niente selettivo ed efficace. Durante l’estrazione porta con sé numerose sostanze estranee come i tannini, antiossidanti che deturpano però il gusto del vino. OCCORRE CAMBIARE TECNICA DI ESTRAZIONE !!!

23. 3. PROVA DI ESTRAZIONE MEDIANTE BAGNO A ULTRASUONI È appurato che gli ultrasuoni abbiano proprietà ausiliario-estrattive. Agiscono sulla membrana delle cellule (in questo caso delle bucce d’uva) rompendola. I pigmenti riescono ad uscire più facilmente dalla cellula!

24. Il bagno ad ultrasuoni • PROCEDIMENTO Un campione di uva fermentata viene fatto macerare in metanolo in un bagno ad ultrasuoni; altri due campioni vengono invece fatti macerare semplicemente in acqua e metanolo. Alla fine del processo vengono confrontate le soluzioni ottenute e la colorazione delle bucce d’uva. RISULTATI Il risultato dell’acqua (bicchiere a sinistra) è deludente e conferma le sue scarse proprietà estrattive verso gli antociani. Non si nota alcuna differenza tra la macerazione in metanolo semplice e la macerazione in metanolo con ultrasuoni (centrale e destro).

25. CONCLUSIONI Gli ultrasuoni non hanno dimostrato proprietà ausiliario-estrattive sulle bucce d’uva. Non ci sono differenze tra una macerazione semplice ed una macerazione supportata da un bagno ad ultrasuoni. OCCORRE CAMBIARE TECNICA DI ESTRAZIONE !!!

26. 4. PROVE DI ESTRAZIONE CON CO2 SUPERCRITICA E AGGIUNTA DI SO2 • Verifica dell’azione decolorante e solvente dell’SO2 PROCEDIMENTO Campioni di uva fermentata vengono fatti macerare in acido solforoso H2SO3 (soluzione di SO2 al 6%). RISULTATI Strepitoso: l’anidride solforosa ha un effetto decolorante e estrattivo notevole verso gli antociani. Un’analisi dell’estratto (cromatografia, prova di solubilità, di degustazione e di colore) conferma ulteriormente i risultati. L’estratto contiene di sicuro Antociani e in discreta quantità.

27. L’azione dell’acido solforoso (ultimo bicchiere), rispetto alle precedenti estrazioni: acqua (primo), metanolo (secondo) e metanolo con ultrasuoni (terzo). Le bucce presentano un’ottima decolorazione. La soluzione risulta chiara per l’effetto candeggiante dell’SO2. In seguito a concentrazione, l’estratto (a destra) si scurisce.

28. FLUIDI SUPERCRITICI Se un vapore viene tenuto ad una pressione sufficientemente elevata, esso passa allo stato liquido (liquefazione). Questo è possibile se esso si trova sotto la sua temperatura critica. Si crea una situazione di equilibrio tra la fase liquida e la fase aeriforme (es. gas accendini). Se la pressione viene aumentata oltre la pressione critica e la temperatura oltre la temperatura critica si passa ad una situazione in cui non esiste più né la fase liquida né quella di vapore, ma una sola fase densa. Questa fase fluida possiede una densità simile a quella del liquido e una viscosità simile a quella del gas.

29. Un gas denso è in grado di: • diffondere come un gas per la sua bassissima viscosità • fungere da solvente come un liquido per la sua elevata densità

30. NUOVA TECNICA Combinando i risultati dell’anidride solforosa… con quelli della CO2 supercritica descritti in letteratura ESTRAZIONE MEDIANTE CO2 E SO2 SUPERCRITICA UNA TECNICA INNOVATIVA E MAI PROVATA PRIMA!!!

31. L’IMPIANTO SEPAREX-SFE500

32. CO2 supercritica PRINCIPIO CO2 Bucce d’uva con acido solforoso Gli antociani sono raccolti in un contenitore

33. PROCEDIMENTO Campioni di bucce d’uva fermentate vengono messi nella camera d’estrazione. Viene fatta passare CO2 supercritica mischiata ad SO2 supercritica, che assieme estraggono gli antociani che vengono raccolti nel contenitore. RISULTATI Le bucce rimangono molto scolorate ma dopo pochi giorni riprendono un po’ di colorazione. L’estratto è di buona qualità, colorazione e gusto.

34. PROBLEMA • L’effetto dell’anidride solforosa è temporaneo e parziale! • Probabilmente la decolorazione delle bucce è dovuta ad una variazione di pH e di struttura degli antociani! Gli antociani a pH 4-5 (incolori) sono più polari !!!

35. SOLUZIONE Mettendo le bucce scolorate in una soluzione abbastanza polare come l’alcol etilico, dovrebbero estrarsi ulteriori antociani! RISULTATI Stupefacenti: le bucce d’uva rimangono permanentemente decolorate e l’estratto è di ottima qualità secondo le analisi! Si tratta di risultati molto promettenti! Nessuno prima d’ora ha potuto constatare una decolorazione così forte sulle bucce d’uva Merlot!

36. Camera di estrazione Cosolvente CO2 + Cosolvente Punto di miscelazione CO2 + cosolvente CO2 supercritica CONCLUSIONI FINALI La tecnica di estrazione è ottima ma va ancora affinata, per esempio mettendo direttamente in circolo l’ H2SO3 supercritico assieme alla CO2. Oppure usando SO2 pura allo stato gassoso! O ancora modificando l’impianto SEPAREX SFE-500!

37. Basico Acido pH 1 3 9 10 13 CURIOSITÀ Il colore degli antociani dipende dal pH. Quando sono incolori sono più solubili in acqua (polare)! Se ci si macchia con degli antociani (uva, mirtilli, ecc…) occorre trattare il capo alternando soluzioni basiche (lisciva) e acide (succo di limone) fino a raggiungere la forma incolore. In seguito si passa al trattamento con acqua!

38. RINGRAZIAMENTI • Ringraziamo tutte le persone che ci hanno aiutato in questo lavoro di ricerca: dalla preparazione, allo svolgimento e alla redazione finale. In particolare i nostri più sentiti ringraziamenti sono rivolti a: • l’enologo e presidente ORPI Bruno Botta • il presidente della Commissione culturale Federviti (Federazione Viticoltori della Svizzera Italiana) Gabriele A. Losa • i professori di chimica del LiLu2 ed in particolare il professor Devittori • il professor Ivo Maroni per averci fatto conoscere e apprezzare la chimica.

39. BIBLIOGRAFIA • Losa, Gabriele, “Salutari questi polifenoli”, in Ticino vino, la rivista di chi ama i sapori della tavola, n. 4, dicembre 2003 • Losa, Gabriele, “Action antioxydante et modulation de l’apoptose par le resvératrol dans les cellules humaines immunocompétentes mononucléaires du sang”, in Bulletin de l’O.I.V. Revue internationale, vol. 46-871-872, settembre-ottobre 2003 • Ribéreau-Gayon P., Glories Y, Maujean A., Dubourdieu D., ‘’Trattato di enologia II’’, Ed agricole, Bologna 2003, pag. 144 • Consiglio federale svizzero, “Ordinanza sulle derrate alimentari”, UFCL, Distribuzione pubblicazioni, Berna, 1° luglio 2004 • Dott. Paronetto Lamberto., Dott. Dal Cin Gildo, “I prodotti chimici nella tecnica enologica”, Scuola d’arte tipografica Don Bosco, Verona, 1954 • Bottinelli Dario, “Estrazione selettiva di antociani dalle bucce d’uva mediante tecnologie innovative”, lavoro di maturità in chimica, LiLu2 Savosa, 2003 • Steinegger, Hänsel, “Pharmakognosie”, 5. Auflage, Sprinter-Lehrbuch, Berlin, 1992, pag. 402 • Ribéreau-Gayon P., Dubourdieu D., Donèche B., Lonvaud A. ‘’Trattato di enologia I’’, Ed agricole, Bologna, 2004 • E.Reverchon, A.Schiraldi, P.Fantozzi; “Fluidi Supercritici: applicazioni agroalimentari”, Raisa, Milano, 1993, pag.38 • Jork, Funk et al, “Dünnschicht-Chromatographie: Reagenzien und Nachweismethoden”, Band 1a, VHC, 1990, pag. 62