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讨论课. 昆虫表达载体. 病毒表达载体. 真核表达载体. 原核表达载体. 酵母表达载体. PCR 产物. A-T 克隆. 测序. 重组表达载体. 制备抗体. 转 染 细 胞. 检测活性. 重 组 蛋 白. 体内、体外. 作用机制. 应用. 步骤：. (1) PCR (2) 核酸的纯化：凝胶回收 Kit (3) 连接反应： 16℃ 过夜 /22 ℃ 2h (4)CaCl 2 法制备感受态细胞： Kit (5) 宿主菌的转化及蓝白筛选 (6) 挑克隆： 2ml 含抗生素的 LB

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Presentation Transcript

  1. 讨论课

  2. 昆虫表达载体 病毒表达载体 真核表达载体 原核表达载体 酵母表达载体 PCR产物 A-T克隆 测序 重组表达载体 制备抗体 转 染 细 胞 检测活性 重 组 蛋 白 体内、体外 作用机制 应用

  3. 步骤： (1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16℃过夜/22 ℃ 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 20~30%甘油-菌液，-20/-70 ℃

  4. (11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、 原位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测： 原核表达：SDS-PAGE (重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化

  5. (14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平 细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。。。。。。。 (17)作用机制

  6. 方法的分类： 1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学

  7. 实验一：A-T克隆 1. PCR：Pfu, 加A尾；[0922/8:00/a 张秀娟] 2. Agarose电泳：Gelred染色;[0922/b王楠 ] 3. 核酸纯化：凝胶回收Kit; [0922/18:30/c穆新燕] 4. Agarose电泳：检测回收条带; [0922/b] 4. 连接反应：pGMT, 4℃过夜; [0922/d刘静轶] 5. 转化：Top10, 热激法，蓝白筛选。[0923/8:00/e宋何煜 ]

  8. 实验二：A-T克隆 1. 挑克隆：2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[0928/8:00/f田士军] 2. 提质粒：Kit；[0929/8:00/g徐菲一] 3. 重组质粒的鉴定：双酶切反应，37 ℃2h；[0929/h李纯] 4. Agarose电泳：Goldview染色；[0930/8:00/b] 5. 测序和序列比对：生物技术服务公司； [0930/h] 6. 菌种保存：20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃。 [0930/h]

  9. 琼脂糖凝胶电泳 PCR 最终产物 1.PCR 3 - 4 小时 紫外灯观察

  10. 组成 a.模板DNA：单链或双链DNA, 避免DNA聚合酶抑制剂和能结合 DNA的蛋白质污染。 b.引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。 0.1~0.5 µmol/L c.Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。 d.dNTP：50~200µmol/L，四种dNTP浓度相同。 e.Taq 酶：Klenow / Taq酶/ 高保真Taq酶, 2.5U/100μl 。 f.参数：94℃ 5min - 30×(94℃ 30sec - 55 ℃ 30sec - 72℃1 min) - 72 ℃7min

  11. 思考题1： 做PCR实验之前，你应该做哪些准备工作？ 1.目的片段大小 2. 仪器设备 3. 试剂 4. PCR参数

  12. 影响因素 模板：ng级的质粒DNA，μg级基因组DNA。 引物：特异性 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性 循环参数：常规为25~30个循环

  13. 思考题2： 下图是PCR结果，每个泳道的模板不同，你如何改进PCR条件 使得A、B、C和D样品能得到特异性好的目的条带？ • 特异性条带弱，非特异性条带弱 • 无特异性目的带，非特异性条带弱 • 特异性条带明显，非特异性明显 • 特异性条带弱，非特异性显著 • 无特异性目的带，非特异性条带强 A B C D E + - Fig2

  14. 思考题3： 请设计将mda-7基因的CDS插入到真核表达载体pSecTag2A中的上下游引物。 载体信息 目的片段酶切位点 读框

  15. 上游有标签 下游有标签 读框 终止码 不用

  16. 上游引物 1 atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtgg act ttagccaga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15 5’保护碱基+酶切位点+起始密码 +目的基因5’末端序列 3’ 上游有标签 读框

  17. 下游引物: 反向互补 586 cttctg acc tggatgcagaaattctacaagctctga 621 196 L L T W M Q K F Y K L * 5’ 保护碱基+酶切位点+终止密码 +目的基因3’末端反向互补序列 3’ 下游有标签 读框

  18. 上游引物 M17 5’ ccca’agctt aatgaattttcaacagagg 3’ HindⅢ 下游引物 • M20 5’ ggg’gt acc gtgag cttgtagaatttctg 3’ KpnI 。。。。 。。。。 6 7 5’ cccaagctt a 3’ gggttcgaa t ac ggt acc cc 3’ tgccatgggg 5’

  19. 0 18 M17 5’ ccca’agcttatgaattttcaacagagg 3’ HindⅢ a

  20. Hind Ⅲ 5’ AAGCCT 3’ 3’ TTCGAA5’ 5’ A 3’ 3’ TTCGG 5’ 5’ AGCCT 3’ 3’ A 5’ + a M17 5’ ccca’agcttatgaattttcaacagagg 3’ HindⅢ

  21. CG/2 30 42 • M20 5’ ggg’gtacc gag cttgtagaatttctg 3’ KpnI gt

  22. KpnⅠ 5’ GGTACC 3’ 3’ CCATGG 5’ CG 5’ GGTAC 3’ 3’ C 5’ 5’ C 3’ 3’ CATGG 5’ + gt • M20 KpnI 5’ tag aaattctacaagctcggtacc cc 3’ • M20 3’ cc c’catggctcgaa cat cttaaa gat 5’ KpnI • M20 5’ ggg’gtacc gag cttgtagaatttctg 3’ KpnI

  23. 上游引物 5’保护碱基+酶切位点+起始密码 +目的基因5’末端序列 3’ 上游有标签，注意读框 A/AB 下游引物: 反向互补 X 5’ 保护碱基+酶切位点+终止密码 +目的基因3’末端反向互补序列 3’ 下游有标签，注意读框 A/AB

  24. 2.琼脂糖电泳 思考题4： 你如何评价下图所示PCR电泳结果？为什么？如有问题如何解决？ • 电泳染料 • PCR

  25. 3.回收 4.连接与转化：4/16 ℃，22 ℃，热激法 5.挑克隆和提质粒 6.双酶切 7.菌种冻存

  26. 思考题5： 你用热激法将连接产物转化到细菌中，LB-Amp平板没有 克隆，请分析可能的原因。 1.LB平板的抗性 2.感受态细菌 3.连接产物

  27. 实验结果分析： 10个克隆，3个阳性，1个测序完全正确。 10 4 2 1

  28. 思考题6： 一位同学未能将PCR产物连入表达载体，请分析可能是哪些环节出问题？ 1.引物设计：内切酶，保护碱基 2.回收—双酶切—回收—连接 3.载体

  29. 8.诱导表达: IPTG，温度 9.超声碎菌：低温 10.SDS-PAGE (1)配胶：分离胶浓度，胶凝时间，储存 (2)上样：30μl/次/道 (3)电泳：90V---120V (4)染色 (5)脱色

  30. 实验三：重组蛋白在细菌中的诱导表达 • 转化：BL21, 热激法；[0928/8:00/i杨海强] • 挑克隆： 2ml Kan+-LB + 1个克隆；[0929/8:00/f] • 转接：20μl过夜菌+ 2ml Kan+-LB, 2管; [0930/8:00/j戴蒙] • 诱导：0.5mM和0.1mM的IPTG（终浓度）; [0930/j] • 碎菌：超声处理; [1013/ 8:00/k 张妮] • SDS-PAGE：10%分离胶，考兰染色，脱色。[1013/l吴昊]

  31. 实验四：Western-blot • SDS-PAGE：10%分离胶；[1013/m吴晓燕] • 转膜：湿转；[1013/n李金龙] • 封闭：RT 1h；[1013/o侯雷] • Ab1：4 ℃过夜 ；[1013/o] • Ab2：RT 40min ；[1014/8:00/p娄亮亮] • ECL：RT 5min ；[1014/p]

  32. His6-Pr 0.1mM IPTG 0.5mM IPTG M 未诱导 全菌 上清 沉淀 全菌 上清 沉淀

  33. 11. WB 1.样品：裂解，超声，离心，低温，总蛋白浓度测定 2.SDS-PAGE: 分离胶浓度(MW) 3.转膜：- 滤纸-胶-NC膜-滤纸 +，转膜条件(MW) 4.丽春红染色：丽春红 5.封闭：5％脱脂奶粉-TBST，RT 1h 摇床 6.Ab1：1:50~1:3000(封闭液)，RT 1h /4℃过夜 7.洗膜：TBST，RT 1h，换液，摇床 8.Ab2：1:3000 (封闭液) ， RT 40min，摇床 9.洗膜：同前 10.ECL显色：RT5min，暗室，X-光片

  34. His6-Pr 0.1mM IPTG 未诱导 全菌 上清 沉淀 IB: His

  35. 思考题7： WB实验中的影响因素有哪些？如果你得到的是没有任何条带的白板，你准备怎么办？ 样品，电泳，转膜，一抗，二抗，ECL 一抗，二抗，转膜，样品，电泳，ECL

  36. 思考题8： 实验室现有的试剂如下： 1M Tris-HCl，1M KCl，Triton X-100 (液体)，30.5% MgCl2(MW95)； 已知1×反应 buffer中各试剂需要量是：10mM TrisHCl, 50mM KCl, 1% Triton X-100, 1.5mM MgCl2。 现在要配5ml的10×反应 buffer，如何用现有试剂配制？请列出计算过程。

  37. 思考题9： 我们实验课用过哪些仪器设备？使用时最需要注意的分别是什么？ 离心机：样品配平和对称放置 PCR仪：禁止低于室温保存 电泳仪：电压不能过高 超声破碎仪：探头侵入液面 超净工作台：紫外灯照射 凝胶成像仪 细菌用恒温摇床 孵箱 水平摇床 水浴锅 金属浴

  38. 思考题： • 对于一个分子生物学的关键词/术语，你有哪些想法？ “基因” 概念—历史—特点—应用 2.你如何理解研究思路和实验技术之间的关系？ “建筑/文章” 相辅相成，缺一不可

  39. 3.你认为在公共实验室做实验应该注意哪些问题？请从正、反两方面说明。3.你认为在公共实验室做实验应该注意哪些问题？请从正、反两方面说明。 安全 做：规定(仪器、试剂、耗材、垃圾)，整洁 看和问： 教 ： 4.如果你做某个实验，三次都未得到你想要的结果，你准备下一步怎么办？ 停----想(设计—操作—结果分析)----问----想----看----想----做

  40. 5. 在分子生物学实验技术中，你掌握得最好的有哪些？最不了解的呢？最想知道的呢？请各列出三个。 6. 就这次课的内容，你认为还可以从哪些角度进行mda-7/IL-24的研究？请说明原因。 7. 请从讲课内容、安排时间和授课方式上，谈谈你对“生物化学与分子生物学实验技术”这门课程的建议。

  41. 感谢大家 对这门课程的关注和参与！

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