19 septembre 2007
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19 septembre 2007 Luc Paillard, CNRS UMR 6061 Luc.paillard@univ-rennes1.fr. Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique. Que sont les régulations post-transcriptionnelles?. AAAAAA. AAAAAA. Que sont les régulations post-transcriptionnelles?. (Régulation de la

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Presentation Transcript
Slide1 l.jpg

19 septembre 2007

Luc Paillard, CNRS UMR 6061

Luc.paillard@univ-rennes1.fr

Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique



Slide3 l.jpg

Que sont les régulations post-transcriptionnelles?

(Régulation de la

stabilité des protéines)

Régulation de la traduction

AAAAAA

Régulation de la

stabilité des ARNm

AAAAAA

Un niveau de contrôle de la concentration

cellulaire en chaque protéine


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« How is gene expression controlled in eukaryotes?

As in prokaryotes, control is exerted primarily

at the level of transcription »

Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988


Slide5 l.jpg

Des altérations de facteurs de régulation

post-transcriptionnelle provoquent

des perturbations phénotypiques

Importance du contrôle post-transcriptionnel

chez les eucaryotes

Des pathologies humaines sont associées

à des défauts de contrôle post-transcriptionnel


Slide6 l.jpg

Des altérations de régulations post-transcriptionnelles

provoquent des perturbations phénotypiques

Mise en place de l’axe antéro-postérieur chez la drosophile


Slide7 l.jpg

Des pathologies humaines sont associées

à des défauts de contrôle post-transcriptionnel

Thalassémies (a ou b) et instabilité des ARNm a ou b globine

Oncogenèse et stabilisation d’ARNm de cytokines/proto-oncogènes


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Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm

Transcription, stabilité des ARNm


Slide9 l.jpg

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm

Transcription, stabilité des ARNm

« Traductome » (gradient) :Accumulation des ARNm dans les polysomes

Traduction des ARNm


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Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm

Transcription, stabilité des ARNm

« Traductome » (gradient) :Accumulation des ARNm dans les polysomes

Traduction des ARNm

Protéome (2DE, MS et dérivés) :niveau d’accumulation des protéines

Traduction, stabilité des protéines


Slide11 l.jpg

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm

Transcription, stabilité des ARNm

« Traductome » (gradient) :Accumulation des ARNm dans les polysomes

Traduction des ARNm

Protéome (2DE, MS et dérivés) :niveau d’accumulation des protéines

Traduction, stabilité des protéines

Relations Transcriptome/traductome/Protéome


Slide12 l.jpg

1. Levures en phase de croissance des régulations post-transcriptionnelles?

Marquage métabolique (Met-35S) des cellules

Séparation des protéines par 2DE

Quantification des spots, identification

Niveaux d’expression de 106 protéines

Gygi et al MCB 1999 19, 1720


Slide13 l.jpg

1. Levures en phase de croissance des régulations post-transcriptionnelles?

Données de SAGE

Niveaux d’expression des ARNm correspondants

Gygi et al MCB 1999 19, 1720


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1. Levures en phase de croissance des régulations post-transcriptionnelles?

Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines

Gygi et al MCB 1999 19, 1720


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1. Levures en phase de croissance des régulations post-transcriptionnelles?

Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines

Corrélation très mauvaise!

Gygi et al MCB 1999 19, 1720


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2. Réponse à un changement de milieu de culture des régulations post-transcriptionnelles?

Culture de levures en galactose

Transfert en galactose ou éthanol

Ratio Gal/Eth mesuré pour 245 produits de gènes :

protéine (ICAT : MS en conditions quantitatives),

ARNm (microarray)

log du ratio des protéines=f(log du ratio des ARNm)

(log=0 pour un produit de gène dont l’abondance ne change pas)

Griffin et al MCP 2002 1, 323


Slide17 l.jpg

2. Réponse à un changement de milieu de culture des régulations post-transcriptionnelles?

R2=0.21!

Griffin et al MCP 2002 1, 323


Slide18 l.jpg

Conclusion des régulations post-transcriptionnelles?

  • Les régulations post-transcriptionnelles sont un niveau

  • MAJEUR de régulation de l’expression génétique

  • 2. (En conséquence, les analyses transcriptomiques

  • peuvent être insuffisantes)


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Bref survol des modalités de régulations post-transcriptionnelles

Structure de l'ARNm eucaryote :

AUG

STOP

5'

AAA….AAA

3'

ORF

5'UTR

3'UTR

Coiffe

Queue poly(A)

Régions non codantes


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Rappels sur la traduction eucaryote post-transcriptionnelles

Initiation

Recrutement de la petite sous-unité ribosomique (40S) à l ’extrémité 5 ’

Scanning jusqu ’à la rencontre de l ’AUG initiateur

Jonction de la grosse sous-unité (60S) = ribosome (80S)

Elongation

Lecture codon par codon

Terminaison

Relargage du peptide

Le ribosome? Influence du contexte du codon stop


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La 5’UTR contrôle la traduction post-transcriptionnelles

1, Les uORF (upstream ORF)

5’UTR de l’ARNm Gcn4 de levure :

4 uORF avant l’ATG initiateur

Réinitiation possible « dans certaines conditions » en 3’ d’une uORF

Ces conditions contrôlent la traduction de GCN4

Gaba et al EMBO J 2001 20, 6453


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La 5’UTR contrôle la traduction post-transcriptionnelles

1, Les uORF (upstream ORF)

Plusieurs (nombreux) ARNm contiennent des uORF, même chez les métazoaires

Fonction???


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La 5’UTR contrôle la traduction post-transcriptionnelles

2, Fixation d’une protéine dans la 5’UTR

La fixation d’une protéine à proximité

de la coiffe (<40nt) inhibe la traduction

Exemple : Contrôle de la traduction de la ferritine par

la séquence IRE et la protéine IRP


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La 5’UTR contrôle la traduction post-transcriptionnelles

3, Les IRES (Internal Ribosome Entry Site)

Initiation indépendante de la coiffe (et de eIF4E)

Traduction de certains ARNm

quand les autres sont réprimés (stress, cycle cellulaire…)


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La 3’UTR contrôle la stabilité post-transcriptionnelles

1, Le récepteur de la transferrine

L'IRP (Iron Response Protein) lie l'IRE (Iron Response Element)

si la concentration cellulaire de fer libre est faible

L’ARNm récepteur de la transferrine contient 5 IRE dans sa 5’UTR

(et un site de clivage endonucléolytique)

Complexe IRE-IRP : inhibition de dégradation

Contrôle de la concentration intracellulaire en fer libre


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La 3’UTR contrôle la stabilité post-transcriptionnelles

2, Les ARE (A/U Rich Element)

Mise en évidence : 1986. ARNm de cytokines, proto-oncogènes…

Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteur

sous contrôle d’un promoteur inductible

Sans ARE

Avec ARE

Xu et al. MCB 2001 21, 6960


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La 3’UTR contrôle la stabilité post-transcriptionnelles

2, Les ARE (A/U Rich Element)

3 classes d’ARE


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La 3’UTR contrôle la stabilité post-transcriptionnelles

2, Les ARE (A/U Rich Element)

Les ARE agissent en fixant une protéine (ARE-BP)

hnRNPD/AUF1, HuR, TTP…

Effet positif ou négatif de la fixation de la protéine


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La 3’UTR contrôle la stabilité post-transcriptionnelles

3, La queue poly(A)

Un ARNm polyadénylé est généralement

plus stable qu’un ARN désadénylé


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La 3’UTR contrôle aussi la traduction post-transcriptionnelles

1, Les ARE (A/U Rich Element)

Vecteur vide

EGFP-ARE

EGFP

Transfection d’un plasmide codant un ARN EGFP

(avec ou sans ARE dans la 3’UTR)

Mesure de l’ARN (Northern) et de

la protéine (western) EGFP

Grosset et al. JBC 2004 279, 13254


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La 3’UTR contrôle aussi la traduction post-transcriptionnelles

2, La queue poly(A)

+/-cap

Luciferase

+/-poly(A)

Incubation dans extrait de levure

Même expérience en présence

d ’anticorps anti PABP

Mesure de luminescence

Pas de stimulation de la traduction

par la queue poly(A)

Tarun et Sachs (1995) Genes Dev 9, 2997


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La 3’UTR contrôle aussi la traduction post-transcriptionnelles

2, La queue poly(A)

+/-cap

Luciferase

+/-poly(A)

Transfection dans les levures

Mesure de luminescence

"wt"

Dpab1

La queue poly(A) stimule la traduction de façon dépendante de la PAB1

Searfoss et al 2001, MCB 21, 4900


Slide33 l.jpg

Mais tout cela est lié! post-transcriptionnelles

1, ARE et état d’adénylation

Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteur

contenant un ARE sous contrôle d’un promoteur inductible

Diminution de taille avant dégradation

Peng et al. MCB 1996 16, 1490


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Mais tout cela est lié! post-transcriptionnelles

2, ARE, état d’adénylation, traduction, stabilité…

+

ARE-BP

STOP

AUG

5'

AAAA...AAAAA

ARE

-

Ri

+

(et c’est encore pire…)


Slide35 l.jpg

La 3’ UTR contrôle la traduction ET la stabilité post-transcriptionnelles

Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants

Une histoire récente…

Et alors?

miRNA

RNAi

siRNA

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519


Slide36 l.jpg

Contrôles post-transcriptionnellespost-transcriptionnels par les ARN non codants

Une histoire récente…

Mécanismes biochimiques

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519


Slide37 l.jpg

Biosynthèse des miRNA post-transcriptionnelles

Reconnaissance d’un ARN

double brin par Argonaute!

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519


Slide38 l.jpg

Fonction des miRNA post-transcriptionnelles

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm

cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt :

Conséquence : inhibition de la

traduction de l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez l’animal

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519


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Fonction des miRNA post-transcriptionnelles

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm

cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :

Conséquence : dégradation

de l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez la plante

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519


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Fonction des miRNA post-transcriptionnelles

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm

cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :

Conséquence : dégradation de l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez la plante…

… Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitement

complémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque

sa dégradation…

voie « siRNA » chez l’animal


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Mise en évidence du RNAi post-transcriptionnelles

Injection d'ARN sens, antisens ou double brin dans la gonade

Phénotype de la descendance?

Prix NOBEL 2006

Fire et al. (1998) Nature 391, 806


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Reprenons… post-transcriptionnelles

miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome

de la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé)

Environ 200 chez l’humain

S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe sa

traduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque

sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…)

En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNm

Une 3’UTR peut être liée par plusieurs miRNA

siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateur

dans une cellule animale

S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation


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Le RNAi, un mode de régulation post-transcriptionnel au service de l’expérimentateur

Application en thérapeutique?

Downward BMJ  2004 328, 1245