第二单元 免疫沉淀实验

1. 第二单元 免疫沉淀实验

2. 实验一 双向免疫扩散试验

3. 实验原理 在琼脂凝胶中，待检人血清IgG和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明两者发生特异性结合反应。

4. 实验器材和材料 试剂 健康人血清，用生理盐水做1:5~1:40系列倍比稀释 、羊抗 人IgG抗血清、10~15g/L琼脂糖或琼脂粉 。 仪器 水浴箱、温箱 。 材料 载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒等 。

5. 实验方法 • 制备琼脂凝胶：用生理盐水配置10～15g/L琼脂，隔水加热煮沸备用。 • 浇板：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取4~4.5ml融化的琼脂倾注于玻片上，滴加时注意速度不要过快，要使琼脂盖满整张玻片，使其均匀、饱满，勿溢出并避免产生气泡。 • 打孔 ：待琼脂凝固后，将梅花形打孔模板置于琼脂板下，用直径3mm的打孔器打孔，使其孔径为3mm，孔距为4mm，孔要求圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与载玻片脱离。 • 加样：用10μl微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体，周围孔分别加入不同稀释度的抗原。 • 温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察沉淀线。

6. 浇板 打孔 加样 结果判断 中央孔—抗体成分 周围孔—不同稀释度的抗原成分（第1~5孔） 第6孔—阴性对照 温育 • 操作示意图 1 6 2 5 3 4

7. 结果判断 以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为人血清IgG的扩散效价。

8. 实验讨论 该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清IgG的检测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP、HBsAg等，但敏感度低所需时间长。 北华大学 王雪松

9. 实验二 单向免疫扩散试验

10. 将一定量的羊抗人IgG抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板，待凝固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀环，沉淀环的直径或面积与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清IgG浓度。 实验原理

11. 实验器材和材料 • 试剂： 待检人血清、免疫球蛋白工作标准（IgG含量为10.10mg/ml）、羊抗人IgG抗血清（单扩效价1:100）、琼脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3。 • 仪器： 水浴箱、温箱 。 • 材料： 载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角烧瓶、湿盒半对数坐标纸等 。

12. 实验方法 • 制备抗体琼脂凝胶:用生理盐水配置10～15g/L琼脂，加0.01%（0.1g/L）NaN3，隔水加热煮沸琼脂，置56℃水浴中备用。吸取99ml已融化的琼脂于三角烧瓶中，置56℃水浴中保温，将预温的羊抗人IgG抗血清1ml与琼脂充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。 • 浇板:将清洁干燥的载玻片置于水平台上，用吸管吸取充分混匀的抗体琼脂4~4.5ml倾注于玻片上，置室温冷却凝固。要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。 • 打孔:待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。要求孔打得圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与玻片分离。

13. 加样:稀释人免疫球蛋白工作标准品：取冻干人免疫球蛋白工作标准品1支加蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为1:5、1:10、1:20、1:40，IgG相应含量为2020、1010、505、252mg/L。稀释待检血清：将待检血清用生理盐水做1:40稀释。用微量加样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品10μl加入到标准抗原孔，制备标准曲线。再用同样的方法吸取已稀释好的待检血清10μl加入到待检血清孔。加样:稀释人免疫球蛋白工作标准品：取冻干人免疫球蛋白工作标准品1支加蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为1:5、1:10、1:20、1:40，IgG相应含量为2020、1010、505、252mg/L。稀释待检血清：将待检血清用生理盐水做1:40稀释。用微量加样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品10μl加入到标准抗原孔，制备标准曲线。再用同样的方法吸取已稀释好的待检血清10μl加入到待检血清孔。 • 扩散:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察结果。如果沉淀环不清晰，可用生理盐水浸泡2~3h。

14. 浇板 1 2 3 4 打孔 加样 5 6 7 8 结果判断 第1、2、3、4、5孔—标准蛋白 第6、7孔—待检抗原 第8孔—阴性对照 扩散 • 操作示意图

15. 结果判断 绘制标准曲线： 以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标，相应孔中的IgG含量为纵坐标，在半对数纸上按Fahey法绘制出标准曲线。 结果判定： 待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即待检标本血清中Ig的实际含量。

16. 实验讨论 单向免疫扩散试验方法简便、易于操作，且重复性和线性均可信赖。但敏感度稍差，观察结果所需时间较长，每次需做参考血清对照，不可一次做成，长期使用。应用此方法除检测人血清IgG含量外，还可用于健康人群或患者血清中IgA、IgM、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含量的定量测定。 北华大学 王雪松

17. 实验三 对流免疫电泳

18. 实验原理 在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；而大部分抗体属于IgG，在此种pH条件下只带微弱的负电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉淀线。

19. 实验器材和材料 • 试剂： 人血清、抗人血清、 pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液 、用巴比妥缓冲液配置1%琼脂 。 • 仪器： 电泳槽、电泳仪、水浴箱 。 • 材料： 孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、吸管、吸球等 。

20. 实验方法 • 制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用75%乙醇冲洗干净，晾干备用。将1%巴比妥琼脂融化后，置56℃水浴中备用。用吸管吸取4~4.5ml琼脂溶液滴加于玻片上，室温放置，待凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。 • 加样：用微量加样器分别吸取抗原10μl加入阴极侧孔内，抗体10μl加入阳极侧孔内，所加样品切勿外溢。 • 电泳：将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加pH8.6的0.05mol/L巴比妥缓冲液至电泳槽的三分之二处，琼脂板两端分别用盐桥与缓冲液相连。控制端电压为5~6V/cm板长，电泳30~60min。电泳完毕后，切断电源。

21. 浇板 Ab Ag 打孔 加样 Ag Ab ﹣ ﹢ 电泳 两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物 。 • 操作示意图

22. 结果判断 在抗原和抗体两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物。如果沉淀线不够清晰，于湿盒中37℃保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。

23. 实验讨论 此方法简便、快捷。敏感性比双向免疫扩散法高8~16倍。需要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结果难以判断。对流免疫电泳在临床常用于某些抗原的定性检测（如AFP、HBsAg等），同时也可用于抗原的半定量测定，或根据沉淀线的位置、形状对抗原和抗体进行相对浓度的分析。由于该方法分辨率差，当多种抗原抗体系统同时存在时，形成的沉淀线常重叠，难以分辨。 北华大学 王雪松

24. 实验四 抗原物质的变化及性质分析 （设计性实验）

25. 抗原概念 是指能够刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与相应免疫应答的产物在体内或体外发生特异性结合反应的物质。

26. 实验原理 大分子的抗原物质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用，生物的某些结构和性状都与这些物质有关。现代分子生物学经常采用一些方法对大分子物质进行有目的的改造，如盐析、甲醛处理、加热、紫外线照射、超声波等，如处理不当这些物质会发生性质上的改变而凝结起来，这种凝结是不可逆的，而且会影响蛋白的性质。我们的目的为寻求是否有简单的方法对处理过程中蛋白的性质进行监控，以观察处理前后抗原物质的性质变化。

27. 实验设计提示 • 首先制备出未处理抗原物质的抗体，用该抗体与处理前和处理后的物质分别进行免疫反应，观察处理前后抗原性是否发生变化。 • 然后制备出处理后抗原物质的另一抗体，用该抗体与处理前和处理后的抗原物质分别进行免疫反应，观察抗原性是否有变化。

28. 1 2 玻片上方两孔分别为未处理抗原（1）和未处理抗原制备的抗体（2）； 玻片下方两孔分别为处理后抗原制备的抗体（3）和处理后抗原（4）。 3 4 实验设计提示 • 通过了解抗原性的变化进一步推断大分子抗原物质的结构和功能是否有新的改变。 • 在试验过程中，通过类似双扩的方法，观察各种抗原和抗体之间的反应及变化。

29. 结果讨论提纲 • 有哪些理化因素能够导致抗原性发生变化，变化的特点和意义是什么？ • 免疫电泳的方法是否可以用于观察抗原物质性质的变化？ • 是否能设计定量观察大分子抗原物质抗原性变化的实验？ 北华大学 王雪松

30. 临床见习 免疫比浊分析系统

31. 见习要点 • 掌握该系统的技术流程及其质量控制； • 熟悉速率散射比浊分析系统的基本原理； • 了解免疫比浊分析系统的种类和原理。

32. 基本原理 • 散射比浊法是指沿水平轴向反应液照射一定波长的光，当光线通过反应体系时，由于抗原抗体反应形成的免疫复合物微粒子对光发生折射、反射及透射，使水平方向的光发生偏转，产生散射光。光线偏转的角度与发射光的波长和反应液中抗原抗体复合物颗粒的大小及多少密切相关。一般仪器采用不同波长的光源两套光路，分别在90°和180°散射角检测小、中和大分子物质。 • 所谓速率是指在单位时间内，抗原抗体反应形成复合物的速度。速率散射比浊法是测定单位时间内免疫复合物形成的最快时间段的散射信号值，当抗体量大于抗原量时，形成的免疫复合物为小分子不溶性颗粒，产生的散射信号最强，形成的速率散射信号值也最大。

33. 免疫浊度分析系统基本技术流程图 依次打开主机电源、电脑及打印机开关，仪器自行启动， 完成初始化和自检，即可开始工作 开机 设置仪器项目和单位等相关参数 参数设置 将试剂盒放入试剂舱内，根据已定程序扫描相关信息 试剂装载 按已设定的参数和程序进行校准 校准 将标本放入标本架，根据已定程序输入工作单 标本装载 按已设定的参数和程序进行测定 标本测定 结果查询与传送 按已设定的参数和程序查看并传送结果 结果报告 以标准模式报告结果并给予解读和对临床提供建议

34. 4 2 4 2 6 6 1 1 5 5 3 3 仪器示意图 ① 试剂区 ② 试剂针 ③ 样本区和稀释液 ④ 加样针 ⑤ 反应区 ⑥ 清洗工作站

35. 检测菜单（举例介绍，并不包含全部）

36. 速率散射比浊法检测的优点 是检测技术的最新发展 适合抗原抗体反应的特性 • 灵敏度高 • 稳定快速 • 线形范围宽 • 易于自动化 • 无放射性污染 • 速率法的动态分析,准确度高, 速度快, 干扰少, • 实测的抗原过量监测真正解决了钩状效应的影响, 排除假阴性结果. 符合检测项目在临床应用 配套有专业系统检测 • 准确可靠 • 简便快速 • 成本低 • 专门的自动化仪器保证了检测过程的方便, 快速和高效. • 原装的试剂和质控保证了检测结果的准确，稳定和可靠.

37. 见习报告 • 结合见习实验室的免疫浊度分析系统，叙述免疫比浊分析仪的检测原理。 • 结合见习实验室的免疫浊度分析系统，简述免疫浊度分析系统的操作程序、影响免疫浊度分析的因素和克服影响因素的措施。 • 免疫比浊分析仪可以检测哪些项目?有何临床意义? 北华大学 王雪松