第七章发酵技术

第七章发酵技术

第一节供氧的控制 一、微生物对氧的需求（一）呼吸强度与耗氧速率微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示。 1. 呼吸强度呼吸强度是指单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以Qo2表示，单位为[mmol（O2）/g（干菌体）·h]。 2. 耗氧速率耗氧速率是指单位体积培养液在单位时间内吸氧量，以r表示，单位为[mmol （O2）/L·h]。呼吸强度可以表示微生物的相对需氧量，但是，当培养液中有固体成份存在，对测定有一定的困难，这时可用耗氧速率来表示。微生物在发酵过程中的耗氧速率取决于微生物的呼吸强度和单位体积液体的菌体浓度。 r = Qo2 · X （7-1）式中： r ——微生物耗氧速率[mmol （O2）/L·h]； Qo2 ——菌体呼吸强度[mmol（O2）/g·h]； X——发酵液中菌体浓度，（g/L）

（二）临界氧浓度 各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低的要求，这一溶氧浓度叫做“临界氧浓度”，以C临界表示。微生物的临界氧浓度一般为0.003~0.05（mmol/L）。当溶解氧浓度低于临界氧浓度时，呼吸强度随着溶解氧浓度的增加而增加，这时若限制溶解氧浓度会严重影响细胞的代谢活动；当溶解氧浓度继续增加，达到临界氧浓度后，呼吸强度保持恒定，与溶解氧浓度无关。利用这一规律，可以指导发酵前期的溶解氧控制。（三）氧的满足度有时溶解氧浓度对细胞生长和产物生成的影响可能是不同的，即对于细胞生长的最佳氧浓度不一定是形成产物的最佳氧浓度。溶解氧浓度与临界氧浓度之比称为氧的满足度。根据氨基酸相对产量与氧的满足度的关系，氨基酸发酵可分为三类：第一类氨基酸的氧的满足度远远大于1，包括谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸等，；第二类氨基酸的氧的满足度稍微大于1，包括赖氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸等。第三类氨基酸的氧的满足度低于1，包括缬氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等，。

二、氧的传质理论 （一）氧传递的阻力在需氧发酵中，氧气从气泡传递至细胞内，需要克服一系列阻力，这些阻力的相对大小取决于流体力学特性、温度、细胞的活性和浓度、液体的组成、界面特性以及其它诸多因素。在传递过程中，传递阻力又可分为供氧方面的阻力和耗氧方面的阻力。供氧方面的阻力是指空气中的氧气从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中所克服的阻力。耗氧方面的阻力是指氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜扩散到细胞内所克服的阻力。（二）气体溶解过程的双膜理论（三）氧传质方程式式7-3计算的结果只能是单位接触界的氧传递速率，实际上很难测定传质界面积，为了方便应用，传质系数引入内界面（以a表示，单位为m2/m3）这一项，即KLa为以氧浓度差为总推动力的体积传质系数，KGa为以氧压力差为总推动力的体积传质系数，KLa和KGa又称为体积溶氧系数。那么，溶氧速率方程为：（7-7）式中： N——单位体积液体氧的传递速率，[mol/（m3·s）]； a——比表面积，（m2/m3）； KLa——以浓度差为推动力的体积溶氧系数，（s-1）； KGa——以分压差为推动力的体积溶氧系数，[mol/（m3·s·MPa）]；

四、提高氧传递速率的措施 （一）提高搅拌的效果 1. 搅拌的作用搅拌装置的作用如下： ①搅拌能把大的空气泡打碎成为微小气泡，增加了氧与液体的接触面积。 ②搅拌使液体作涡流运动，使气泡不是直线上升而是作螺旋运动上升，延长了气泡的运动路线，即增加了气液的接触时间。 ③搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少了气泡周围液膜的厚度，减少液膜的阻力。 ④搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递中的接触面积的增加，使推动力均一，同时，也减少菌体表面液膜的厚度，有利于氧的传递。 2. 选择适当的搅拌器形式搅拌器按液流形式可分为轴向式和径向式两种。目前，氨基酸发酵罐的一般采用圆盘涡轮式搅拌器，属于径向式。若发酵罐搅拌不带挡板且无冷却排管，轴心位置的液面下陷，形成一个很深的凹陷旋涡（见图7-10）。此时液体轴向流动不明显，靠近罐壁的液体径向流速很低，搅拌功率也下降，气液混合不均匀，不利于氧的溶解。实际生产中，当发酵罐冷却排管的排列位置以及组数恰当，起到全挡板作用，可不设置挡板。如果冷却排管不能满足全挡板条件，液面仍会出现深度不同的凹陷旋涡。

圆盘涡轮式搅拌器的叶片有弯叶、直叶、箭叶和半圆叶多种形式，多数氨基酸生产工厂采用六弯叶圆盘涡轮式搅拌器。圆盘涡轮式搅拌器的叶片有弯叶、直叶、箭叶和半圆叶多种形式，多数氨基酸生产工厂采用六弯叶圆盘涡轮式搅拌器。 3. 确定适当的搅拌叶轮相对位置在氨基酸的实际生产中，下档搅拌叶轮与罐底距离一般为（0.8~1）d（搅拌直径），两档搅拌叶轮之间的距离一般为（3~4）d。 4. 确定适合的搅拌叶轮组数目前，氨基酸发酵罐的搅拌叶轮组数多为3或2组。 5. 确定适当的搅拌转速和叶径目前，氨基酸发酵罐的搅拌功率与容积之比一般为（1~1.2）kw /m3。通常从发酵液的粘度、发酵罐的高径比、搅拌器形式、空气流量等方面来考虑搅拌转速n和叶径d之间的搭配。六箭叶圆盘涡轮六弯叶圆盘涡轮六直叶圆盘涡轮六半圆叶圆盘涡轮

（二）适当提高空气的线速度 研究表明，发酵罐中实际空气流速的上限为1.75~2.0m/min，因此，生产中要根据实际情况来选择空气的线速度，适当提高空气线速度时应避免空气“过载” 现象。（三）采用合适的空气分布管空气分布管的型式、喷口直径及管口与罐底距离的相对位置对氧溶解速率有较大的影响，在发酵罐中采用的空气分布装置有单管、多孔环管、单管配多孔风帽及多孔分支环管等几种。（四）适当增加氧的分压氨基酸生产中，罐压一般为0.05~0.10MPa。（五）选择适当的发酵罐高径比目前，氨基酸发酵罐的高径比通常选取2~3。（六）尽可能选取体积大的发酵罐一般来说，大体积的发酵对氧的利用率高，而小体积的发酵罐对氧的利用率低。（七）注意控制培养液的物理性质因此，培养基的选择和配制时尽可能考虑这些因素，并加以控制；发酵过程中使用适量的消泡剂进行消除泡沫，改善气液体混合效果，提高氧的传递速率。

五、生产上溶氧控制的操作 （一）调节通气量发酵及其配套设备一旦经过设计、加工、安装后，在发酵生产的运行中，许多影响供氧效果的因素基本固定不变。调节通气量是氨基酸生产中的溶氧控制的主要手段，可通过调节发酵罐的进气阀门以及排气阀门的开度以完成调节通气量的操作，从而满足微生物在不同发酵阶段的需氧量。生产中关于通气量的调节操作有两种描述，一种是直接以空气流量大小来表示，单位一般为m3/h；另一种以通气强度（又叫通气比）大小来表示，即每立方米发酵液每分钟通入多少立方米的空气，单位是VVm。（二）调节搅拌转速氨基酸发酵生产中，可通过变频器控制电机的转速以完成控制搅拌转速的操作。（三）调节罐压在很多小型试验中，采用通入纯氧的方法来改变空气中氧的分压，对一些好气性发酵产率的提高有明显促进作用。

第二节温度的控制 一、温度对微生物生长和代谢的影响（一）温度对微生物生长的影响在低温环境中，微生物生长延缓甚至受抑制；在高温环境中，微生物细胞的蛋白质易变性，酶活性易遭受破坏，故微生物易衰老甚至死亡。因此，各种微生物在一定的条件下都有一个最适的生长温度范围。在此范围内，生长速度随温度升高而加快。（二）温度对产物形成的影响细胞内氨基酸合成是一系列酶促反应的结果，故产物形成也有一个最适温度范围。从酶反应动力学来看，在最适合成温度范围内升高温度，就可加快反应速度；从整个发酵过程来看，提高温度可促使产物提前生成。但酶本身极易因过热而失活，温度愈高失活愈快，表现为细胞过早衰老，使发酵周期缩短，从而影响发酵的最终产量。对于同一微生物细胞，细胞生长和代谢产物积累的最适温度也往往是不同的。例如，谷氨酸生产菌生长的最适温度为31~33℃，而代谢产生谷氨酸的最适温度却在35~37℃。（三）温度对发酵液物理性质的影响温度可以改变培养液的物理性质，从而间接影响到微生物细胞的生长。例如，温度通过影响氧在培养液中的溶解氧浓度、氧传递速率、基质的分解速率等，从而影响到发酵。

二、发酵热引起温度的变化 发酵过程中，随着微生物对培养基中的营养物质的利用、机械搅拌的作用，将会产生一定的热量；同时由于发酵罐壁的散热、水分的蒸发等将会带走部分热量。习惯上将发酵过程中释放出来的引起温度变化的净热量称为发酵热，以J/（m3﹒h）为单位。发酵热包括了生物热、搅拌热、蒸发热以及辐射热等，即Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射。（一）生物热（Q生物）在微生物生长繁殖过程中，本身产生的大量热称为生物热。（二）搅拌热（Q搅拌）对于机械搅拌通气式发酵罐，由于机械搅拌作用，造成液体之间、液体与设备之间的摩擦，使机械搅拌的动能转化为摩擦热而释放在发酵液中，此为搅拌热。（三）蒸发热（Q蒸发）在通气培养过程中，空气进入发酵罐后与发酵液充分接触，大部分气体从发酵液出来，排放至大气中，热量将被空气或蒸发的水分带走，这部分热量就称为蒸发热。（四）辐射热（Q辐射）辐射热是指因发酵罐温度与罐外环境温度不同，而使发酵液通过罐体向外辐射的热量。三、温度的测量与发酵热的测量和计算（一）温度的测量传统上用玻璃温度计测量发酵温度。目前普遍采用热电偶测量发酵温度。（二）发酵热的测定和计算四、发酵温度的控制（一）温度控制的方法一般情况下，对于菌体最适生长温度与产物最适生成温度不同的氨基酸发酵，生产上采用多级温度控制的方法。（二）生产上温度的控制操作以及自动控制

第三节 pH的控制 一、pH对微生物生长和代谢的影响 1. 影响酶的活性 2. 影响细胞膜的电荷状态 3. 影响培养基某些组分和中间代谢产物的解离 4. 影响某些生物合成途径的方向二、引起pH值变化的原因培养基中碱性物质的消耗和酸性物质的生成可引起pH值下降，而酸性物质的消耗和碱性物质的生成可引起pH值上升。另外，其他发酵条件的改变、菌体自溶以及杂菌污染也会引起发酵液pH值的变化。正常情况下，氨基酸发酵中培养基的碳源不断被氧化为有机酸，氮源不断被消耗，以及氨基酸不断积累，发酵液的pH值有不断下降的趋势。三、pH的检测和控制（一）发酵过程pH的检测发酵过程中pH测量十分重要，只有通过pH测量才能发现发酵pH的变化规律。实际生产中，通常采用pH试纸、pH电极对pH值进行测量。（二）发酵过程pH的控制 1. 发酵最适pH的确定总之，以促使产物产量达到最大为目的，根据发酵实验结果来确定发酵过程不同阶段的最适pH范围。 2. 发酵过程pH的控制方法若pH值偏高不多，培养基碳源物质浓度又较低，可补加适量葡萄糖液进行调节；如果培养基氮源物质浓度较低，可补加适量硫酸胺溶液进行调节。若pH值偏高较多，应立即补加酸液进行调节 • （三）发酵过程pH的自动控制

第四节泡沫的控制 一、泡沫的形成及其对发酵的危害（一）泡沫形成原因以及规律泡沫形成有一定规律。泡沫的多少既与通风量、搅拌的剧烈程度有关，又与培养基所用原材料的性质有关。培养基的灭菌操作和其它发酵条件也会影响到泡沫的产生。菌体本身具有稳定泡沫的作用，发酵液的菌体浓度越大，发酵液越容易起泡且泡沫持久稳定。如果发酵污染杂菌或噬菌体，或发酵控制不当，菌体自溶严重，泡沫将会特别多。（二）泡沫对发酵的危害过多泡沫产生，若消除不及时，将造成大量逃液，导致产物的损失和周围环境的污染；若泡沫从搅拌的轴封渗出，增加发酵染菌的机会；泡沫增多使发酵罐的装填系数减少；持久稳定的泡沫影响通气搅拌的正常进行，使溶氧效果降低，同时代谢气体不容易排出，影响菌体的正常呼吸作用。二、泡沫的控制（一）机械消泡目前，氨基酸发酵工厂较多使用罐内耙式消泡器与罐外旋击分离器结合的机械消泡的方式。机械消泡的优点是不需要往发酵液添加消泡物质，可节省消泡剂，减少添加消泡剂时可能带来的染菌机会。但机械消泡并不能完全消除泡沫，故通常将机械消泡作为化学消泡的辅助方法。

（二）化学消泡 化学消泡即是使用化学消泡剂进行消除泡沫，是目前发酵工业上应用最广的一种消泡方法。其优点是消泡作用迅速可靠，但消泡剂用量过多会增加生产成本，且有可能影响菌体的生长、代谢，对产物的提取、精制不利。 1. 化学消泡的机理一般情况下常良好的化学消泡剂同时具备降低液膜的机械强度和表面黏度的两种性能。 2. 选择消泡剂的原则 3. 发酵工业常用的消泡剂 ①天然油脂类发酵工业中常用的天然油脂类化学消泡剂主要有玉米油、米糠油、豆油、菜油等； ②高级醇类生产上应用的高级醇类有聚二醇、十八醇等； ③聚醚类生产上应用较多的有聚氧丙烯甘油等； ④硅酮类硅酮类消泡剂主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物； 4. 化学消泡剂的使用为了能够迅速有效地消除泡沫，要求消泡剂具备极强的消泡能力和扩散能力。这些主要取决于消泡剂的种类和性质，但可以借助机械、载体或分散剂来增强消泡剂在发酵液中的扩散速度，如用聚氧丙烯甘油作消泡剂时，以豆油为载体的消泡增效作用相当明显；也可以多种消泡剂并用，以增强消泡能力，如用0.5%~3%的硅酮、20%~30%的植物油、5%~10%的聚乙醇二油酸脂、1%~4%的多元脂肪酸与水组成的混合消泡剂，具有明显的增效作用。

第五节补料的控制 发酵工业上，中间流加生产菌所需要的碳源、氮源、微量元素、无机盐以及诱导底物等物质，通常称为补料。正常情况下，氨基酸生产中一般补充碳源和氮源。一、补料的目的采用丰富培养基可提高产量，但基础料的浓度过高，培养基的黏度增大，不利于氧的传递以致溶解氧下降，渗透压增大又会对生产菌造成的抑制，同时有可能使泡沫过早形成，给发酵带来不利。于是，人们采用中间补料的方法来解决这个矛盾，既可以避免高底物浓度的不良影响，又可以使产物合成的旺盛期延长，达到提高发酵产量的目的。二、补料的控制内容（一）补料时间通常在微生物细胞进入产物合成期以后才开始补料。同时，一般在适当的残留底物浓度开始补料。（二）补料速率通过控制料液流速来控制补料速率，为了使残留底物浓度相对稳定，补料时应注意控制料液流速。（三）补料配比微生物的生长、代谢总是要求培养基的营养成分有一个合理的配比。三、补料的方式（一）间歇流加间歇流加是指在发酵过程中，补充的物料分成若干次流加到发酵罐中。（二）连续流加连续流加是指在发酵过程中,补充的物料连续流加进入发酵罐中。

第六节淀粉糖原料生产谷氨酸的发酵技术 一、谷氨酸发酵技术概述（一）目前国内谷氨酸发酵生产工艺的分类 1. 按碳源原料划分国内谷氨酸生产的碳源原料主要有淀粉糖和糖蜜两类。 2. 按生产菌株的类型划分国内谷氨酸生产菌株主要有生物素缺陷型菌株和温度敏感型菌株。 3. 按培养基含生物素量大小划分以前，采用淀粉糖原料的工厂一般控制发酵培养基的生物素浓度为5~6μg / L，传统中称之为生物素“亚适量”工艺。随着发酵条件的优化，有些工厂将培养基生物素浓度控制在8~12μg / L，可显著提高谷氨酸产酸水平，为区别传统的生物素“亚适量”工艺，有人称之为生物素“超亚适量”工艺。 4. 按接种量大小划分一般工程技术人员所说的接种量，是指接入发酵罐的成熟种子醪的体积相对于发酵初始体积的百分比。目前谷氨酸发酵工艺趋向于大种量，一般在5~10%。 5. 按发酵初糖浓度划分根据发酵初糖浓度高低，大致可将发酵工艺划分为低初糖工艺、中初糖工艺和高初糖工艺。 6. 按发酵过程补加糖液划分从是否补加糖液的角度来看，有需要补糖工艺和不需要补糖工艺。（二）国内谷氨酸发酵工艺及其发酵水平的现状

二、中初糖流加高浓度糖液的生物素“超亚适量”工艺二、中初糖流加高浓度糖液的生物素“超亚适量”工艺（一）工艺流程及谷氨酸发酵记录表 1. 工艺流程工艺流程见图7-20。

（二）培养基的配方 1. 二级种子培养基：葡萄糖 300kg；KH2PO4 12 kg；MgSO4﹒7H2O 6 kg；糖蜜 100 kg；玉米浆 200 kg；纯生物素 150 mg；消泡剂 1.5 kg；定容7000L，实消，121℃保温10min。 2. 发酵基础培养基：葡萄糖 18800kg；85%的H3PO4 120 kg；KCL 200 kg ；MgSO4﹒7H2O 140 kg；糖蜜 200 kg；玉米浆 600 kg；纯生物素 300 mg；消泡剂 10 kg；定容102m3，连消温度121~122℃，维持8~10min。（三）培养基的构成原理与控制要点 1. 碳源采用淀粉水解糖液作为碳源。 2. 氮源 3. 无机盐 ① 磷酸盐② 硫酸镁③ 钾盐④微量元素 4. 生长因子（四）生物素缺陷型菌株的主要特征虽然从细菌的鉴定和分类的结果来看，现有谷氨酸生产菌分属于棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属，但是它们在形态及生理方面仍有许多共同的特征。可归纳为：（1）细胞形态为球形、棒形以至短杆形；（2）革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动；（3）都是需氧型微生物；（4）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸。

（五）二级种子的培养 （六）发酵过程的菌体形态变化在生物素限量的培养条件下，根据谷氨酸发酵过程的菌体形态变化，大致可将细胞分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞三种不同时期的细胞形态。（七）发酵过程的控制 1. 温度的控制根据实例的温度控制的数据，我们可以看到发酵过程中温度不断升高的趋势 2. pH的控制在正常情况下，为了保证足够的氮源，满足菌体生长和谷氨酸合成的需要，通常将发酵pH控制在稍微偏碱性的状态。由于提取谷氨酸多用等电点法，为了提取工序节省酸的用量，发酵后期将近放罐时，一般控制pH7.0~6.5。 3. 通气量的控制 4. 流加糖的控制 5. 泡沫的控制（八）发酵指标及其计算 1. 产酸水平产酸水平是单位体积发酵液中含有谷氨酸的量，通常用g/L或g/100ml来表示。单罐的谷氨酸产量=产酸率×放罐体积 2. 放罐体积放罐体积是发酵结束以后移交给提取工序的发酵液体积，通常以m3或L来表示。 3. 糖酸转化率糖酸转化率是产出的谷氨酸量与投入的葡萄糖总量的百分比。 4. 发酵周期发酵周期是指发酵开始至结束整个过程的时间，用h来表示。

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