第二章：培养基及其制备

1. 第二章：培养基及其制备 培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 发酵培养基的作用： • 满足菌体的生长 • 促进产物的形成

2. 微生物的化学组成是研究微生物营养的基础 元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫 化合物:水分、糖类、蛋白质、核酸、脂质、维生素、无机盐等。 细胞的化学组成与菌龄、培养条件、环境、生理特征有关。 第一节 微生物细胞的化学组成及胞外代谢产物

3. 代谢副产物 中间代谢产物 次级代谢产物 胞外水解酶类 二、微生物胞外代谢产物

4. 培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 培养基的原材料：碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子、前提物质、水 第二节 培养基的组成

5. 可以构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质可以构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质 1. 糖类：单糖、双糖、多糖、淀粉质类、糖蜜 2. 脂肪：豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、玉米油等 3. 有机酸：乳酸、柠檬酸、延胡索酸、高级脂肪酸等 4. 烃和醇类：正烷烃、乙醇 一、碳源

6. 能被微生物利用以构成细胞物质或代谢产物中氮素的营养物质通常称为氮源。有无机氮源和有机氮源两种。能被微生物利用以构成细胞物质或代谢产物中氮素的营养物质通常称为氮源。有无机氮源和有机氮源两种。 1. 有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉等等。 2. 无机氮源：铵盐、硝酸盐和氨水等。 二、氮源

7. 低浓度促进生长、高浓度抑制生长。 磷、镁、硫、铁、氯、钾、钠、钙等 三、无机盐及微量元素

8. 生长因子不是对所有的微生物都是必须的，它只对某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的。例如谷氨酸产生菌生长因子不是对所有的微生物都是必须的，它只对某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的。例如谷氨酸产生菌 四、生长因子

9. 某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物再生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有太大的变化，但是产物的产量却因其加入而有较大的提高。这类化合物称为前体。某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物再生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有太大的变化，但是产物的产量却因其加入而有较大的提高。这类化合物称为前体。 五、前体

10. 促进剂是一类刺激因子，不是前体或营养物，对细胞的生长是非必需的，但加入后却能显著的提高发酵产量。促进剂是一类刺激因子，不是前体或营养物，对细胞的生长是非必需的，但加入后却能显著的提高发酵产量。 促进剂的作用效果受到菌龄、菌种和培养基组成的影响。 抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径的活跃。 六、促进剂和抑制剂

11. 作用：1. 溶剂与运输介质的作用 2. 参与细胞内的一系列化学反应 3. 维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象 4. 保持细胞内温度稳定 七、水

12. 发酵培养基的要求 ① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 ③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。 ④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。

13. 第三节 培养基的类型及功能 一、培养基按其组成物质的纯度、状态、用途、生产目的可分为四大类型 1、按纯度 合成培养基: 原料其化学成分明确、稳定 • 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 • 培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产 天然培养基: 采用天然原料 • 原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业 化生产 • 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 半合成培养基

14. 培养大肠杆菌常用两种培养基 M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10, pH 7.0 YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2

15. 2、按状态 固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8% ,主要用于微生物的鉴定。 液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。 3、按生产目的（从发酵生产应用考虑） 培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种

16. 4. 按用途分：增殖培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基。

18. 工业培养基的作用 ：满足菌体的生长 促进产物的形成 发酵培养基的要求： ① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 ③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。 ④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。 第四节 工业培养基的选择和配制原则

19. 1、选择培养基的基本原则 必需提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 有利于减少培养原料的单耗，提高单位营养物质所合成产物的数量或最大产率。 有利于提高培养基和产物浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 所利于提高氧的利用率，降低能耗。 有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”物质。用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，

20. 2、选择培养基的方法 • 了解生产菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求； • 了解生产菌种的培养条件、产物形成、一般提炼方法、产品质量要求等。 • 摇瓶试验和小型发酵罐培养，摸索有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。 • 确立一个培养基配比，再做各种重要的金属和非金属离子的影响试验。 • 复合培养。 • 试验各种发酵条件和培养基的关系 • 中间补料方法的研究：调节碳氮；添加中间体

21. 3、培养基的配制原则 （1）根据微生物的营养需要配制培养基 （2）营养成分的恰当配比 （3）渗透压 （4） pH （5）氧化还原电位

22. 第五节 淀粉水解糖的制备 一、糖是最主要的碳源 • 作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分 提供合成目的产物所必须的碳成分 • 来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃

24. 所有的微生物都能利用葡萄糖 • 但是会引起葡萄糖效应 • 工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质 量指标

25. （一）、有关的概念 糖化：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。 淀粉糖：由淀粉制得的水解糖液，其主要成分是葡萄糖、少量麦芽糖和其他二糖、低聚糖、复合糖类、原料带来的杂质（如蛋白质、脂肪等）及其分解产物。 易被利用的淀粉水解产物：葡萄糖、麦芽糖及蛋白质、脂肪分解产物即氨基酸、脂肪酸等是微生物生长的营养物 不能被利用的淀粉水解产物：一些低聚糖类及复合糖类等杂质。

26. （二）、淀粉水解糖的制备方法 1、酸解法（酸糖化法） （1）原理：它是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。 （2）优点： 生产简易，由淀粉逐步水解为葡萄糖的整个化学反应过程，仅仅在一个高压容器里进行，对设备要求简单； 水解时间短（如采用10°Be′浓度淀粉，在0.294MPa（表压）压力下需20min左右；在0.343MPa（表压）下仅需7－10min即可将淀粉转化为葡萄糖）； 设备生产能力大。

27. （3）缺点 由于水解作用是在高温、高压及一定酸浓度条件下进行的，因此，酸解法要求有耐腐蚀、耐高温、高压的设备； 淀粉在酸水解过程中所发生的化学变化是很复杂的，除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，这将造成葡萄糖损失而使淀粉转化率降低； 对淀粉原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀，颗粒大，易造成水解不透彻；淀粉乳浓度也不宜过高，浓度高，淀粉转化率低。

28. （三）、淀粉酸水解理论基础 在淀粉糖化过程中，同时发生三种反应： 淀粉水解反应：淀粉经水解反应生成葡萄糖； 复合反应：是葡萄糖分子经1，6键结合成龙胆二糖、异麦芽糖和其他低聚糖。 分解反应：是葡萄糖分解为羟甲基糠醛、有机酸和有色物质等非糖产物。 三种反应的关系： 淀粉的水解反应：主要反应； 葡萄糖的复合和分解反应：次要反应；

29. 淀粉水解的过程： 淀粉→糊精→低聚糖→麦芽糖→葡萄糖 糊精及其性质 糊精：若干种分子大于低聚糖的碳水化合物总称。 性质： 有旋光性、还原性，能溶于水，不溶于酒清。 呈色反应： 一般聚合度（葡萄糖单位）＞30－35时，呈蓝色；随着聚合度的降低，呈暗紫→紫→红褐→暗红→红→浅红。 糖化液的还原性：淀粉水解生成的葡萄糖、麦芽糖及低聚糖等具有还原性基团。

30. 2、葡萄糖的复合反应 复合反应 在淀粉的酸糖化过程中，葡萄糖受酸和热的催化，通过糖甙键相聚合，失掉水分子，生成二糖、三糖和其他较高的低聚糖等。 复合反应的特点 复合反应是可逆的。 复合反应进行的程度及所生成复合糖的种类因反应条件（如糖浓度、酸种类、酸浓度、温度等）而不同。

31. 3、葡萄糖的分解反应 葡萄糖脱水发生分解反应，生成5’-羟甲基糠醛，进一步分解为乙酰丙酸、蚁酸等物质。 发生聚合，或与淀粉中的有机物质相结合，产生色素。影响葡萄糖液的质量。

34. 2、酶解法 （1）原理：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖。“液化”和“糖化”都是在微生物酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。 （2）步骤： 液化：利用α-淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加； 糖化：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程。

35. （3）优点： 条件较温和，因此不需耐高温、高压、耐酸的设备，便于就地取材，容易上马。 专一性强，副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率（出糖率）高。 可在较高淀粉乳浓度下水解。 酸解法一般作用10－12°Be′（含淀粉18％-20％）； 酶解法用20－23°Be′（含淀粉34％－40％），而且可采用粗原料。 由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，这就使发酵培养基的组成可加以简化。 用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。

36. （4）缺点： 反应时间较长（从投料到糖化完毕需2－3天），要求的设备较多； 需要具备有专门培养酶的条件； 由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。

37. 3、酸酶结合法 （1）酸酶法 原理：事先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。 适用范围：颗粒较紧密的原料（如谷物淀粉）。 优点：酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。

38. （2）酶酸法 原理：将淀粉乳先用α-淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖的工艺。 适用范围：颗粒大小不一（如碎米淀粉等）的原料。 优点：能采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法高，生产较易控制，时间短，而且酸水解pH稍高，可减少淀粉水解副反应的发生，糖液色泽较浅。 酶法制葡萄糖，采用较高淀粉浓度，提高设备生产能力，节省酸、碱的消耗。

39. 不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大

40. 1、液化工艺 （1） 一次加酶喷射液化工艺 二次加酶喷射液化工艺 （2）淀粉酶液化条件的选择 温度的选择：95-110摄氏度 液化pH的选择：6-7 酶制剂用量的选择：5-8U/g 液化程度控制：DE值在10%-15% （四）、酶解法制备葡萄糖的工艺

41. 2、糖化工艺 液化液 糖化罐 灭酶 脱色罐 过滤机 贮罐 酸、糖化酶 蒸汽 碱液、活性炭、助滤剂

42. 3、糖化工艺条件 （1）温度：55-65摄氏度 （2） pH：4.4-4.6 （3）酶制剂的用量：80-100U/g （4）时间控制：24h，DE值96%-98% （5）脱色与过滤：活性炭，脱色温度控制在60-65摄氏度

43. 第三节 糖蜜的前处理 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。

44. 不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响

45. 甘蔗糖蜜为棕黄色至黑褐色的均匀浓稠液体，要求无夹杂物，无异臭味，无发酵迹象，因所含糖分与微生物的数量不同而分为三级，但各地区的具体要求也略有差异，例如甘蔗糖蜜为棕黄色至黑褐色的均匀浓稠液体，要求无夹杂物，无异臭味，无发酵迹象，因所含糖分与微生物的数量不同而分为三级，但各地区的具体要求也略有差异，例如 四川内江糖厂的糖蜜按下列要求分三级： 一级糖蜜：含糖分为58——65％；含微生物1.0——9.0万个／1克； 二级糖蜜：含糖分为52——58％；含微生物15——50万个／1克； 三级糖蜜：含糖分为46——52％；含微生物100——800万个／1克。 广东顺德糖厂的糖蜜按下列要求分三级： 一级糖蜜：含糖分为50％以上； 二级糖蜜：含糖分为48——50％； 三级糖蜜：含糖分为48％以下。 糖蜜的分级：

46. 项    目 辽宁 黑龙江 锤度（Bx） 81.60 79.6 全糖分% 48.76 49.4 蔗糖% 48.76 49.27 转化糖% / 0.13 纯度 % 59.76 62.0 PH 7.4 7.4 胶体% 10.00 10.00 硫酸灰分 % 7.33 10.00 总氮量% 2.08 2.16 磷酸（P2O5）% 0.029 0.035 甜菜糖蜜的成分

47. 干物质浓度很大 糖分高 产酸细菌多 灰分与胶体物质很多 如果不预先进行处理，酵母是无法直接进行发酵的。因此必须进行预处理。 糖蜜酒精发酵的特点

48. 稀释 酸化、灭菌、澄清、添加营养盐 糖密的处理程序

49. (一)糖蜜的稀释方法 糖蜜的稀释方法可分为间歇与连续两种： 1．间歇稀释法 糖蜜的间歇稀释是在稀释罐内进行；稀释罐内附有搅拌器。如果工厂原有糖化锅设备，一般都利用糖化锅作稀释设备。 糖蜜间歇稀释法是先将糖蜜由泵送入高位槽，经过磅秤称重后流入稀释罐，同时加入一定量的水，开动搅拌器充分拌匀，即得所需浓度的稀糖液，经过滤后可供酒母培养和发酵用。 糖蜜的稀释

50. 2．连续稀释法 目前我国糖蜜酒精工厂多采用连续稀释法，糖蜜连续稀释是通过连续稀释器进行。