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第七单元 超敏反应性疾病的免疫学检测. 实验一 血清 IgE 的检测. 一、血清总 IgE 的检测. 实验目的 1. 掌握 ELISA 双抗体夹心法测定血清总 IgE 的方法。 2. 熟悉 IgE 在 I 型超敏反应中的作用和临床意义。. E E. E. E. 实验原理 ELISA 双抗体夹心法. 酶标抗体. 待测抗原. 包被抗体. 洗涤. 实验材料 1. 羊抗人 IgE 抗体、 HRP 标记的羊抗人 IgE 抗体、 IgE 校准品、 TMB （四甲基联苯胺）。 2. 标本：待测血清。
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第七单元 超敏反应性疾病的免疫学检测
一、血清总IgE的检测 实验目的 1.掌握ELISA双抗体夹心法测定血清总IgE的方法。 2.熟悉IgE在I型超敏反应中的作用和临床意义。
E E E E 实验原理 ELISA双抗体夹心法 酶标抗体 待测抗原 包被抗体 洗涤
实验材料 1.羊抗人IgE抗体、HRP标记的羊抗人IgE抗体、IgE校准品、TMB（四甲基联苯胺）。 2.标本：待测血清。 3.包被缓冲液、洗涤缓冲液、反应终止液（2 mol/L H2SO4）等。 4.酶标板、微量加样器、酶标仪、温箱等。
E E E E 操作步骤 1.包被羊抗人IgE抗体（4℃过夜，洗涤） 2.封闭（0.5%的小牛血清或牛血清清蛋白） 3.加样（梯度稀释的IgE校准品、待测血清、阳性对照、阴性对照、空白对照） 4.37℃温育2h，洗涤 5.加入工作浓度的HRP标记的羊抗人IgE 6.37℃温育2h，洗涤
7.加入底物，37℃温育15分钟 8.加入终止液，终止反应 9.492nm波长测各孔吸光度值（A值）
注意事项 1.包被抗体量、酶标抗体的加入量等可影响测定结果，需预先摸索最佳条件。 2.洗涤要彻底，必要时可加大洗涤液的浓度。 3.结果判断须在10分钟内完成。 4.IgE含量与吸光度值在一定范围内呈线性关系，如果样品的测定结果超出此范围，应对样品进行适当的稀释，使样品中IgE的浓度在线性范围内再行测定。
结果分析 以IgE校准品的参考含量（IU/ml）为横坐标，以对应A值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测样品的A值，在标准曲线中查出稀释后样品中IgE的浓度，再乘以稀释倍数，即为原样品中IgE的浓度。1IU=2.4ng。
临床意义 血清总IgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示，1IU＝2.4ng，相当于WHO标准冻干血清制剂0.00928mg内所含的IgE量。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐带血IgE水平小于0.5IU/ml，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。成人血清IgE水平约在20～200IU/ml之间，一般认为大于333IU/ml（800ng/ml）时为异常升高。 IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。上述疾病时IgE升高的程度并不一致，在过敏性支气管肺曲菌病时最为显著，其值可达5000～20000ng/ml，除了此病和特应性皮炎以及在花粉季节之外，任何血清总IgE水平大于5000ng/ml的患者均应考虑寄生虫感染的可能性。
思考题 1. ELISA双抗体夹心法定量测定血清总IgE的原理及应注意的问题有哪些？ 2. 测定血清总IgE的临床意义？
二、血清特异性IgE的检测 实验目的 1.掌握斑点酶免疫印迹法检测sIgE的原理和方法。 2.熟悉sIgE在I型超敏反应中的作用和临床意义。
实验原理 斑点酶免疫印迹法：用NC膜作为固相支持物，检测区的不同区域包被有特异性的过敏原，质控区包被有兔抗鼠Ig抗体。检测时将稀释的病人血清加入反应槽内，血清中的sIgE与NC膜上的相应过敏原结合。通过洗涤去掉未结合的游离物质，再加入酶标记的抗人IgE抗体，此抗体会与检测区NC膜上的sIgE结合，同时会与质控区上的兔抗鼠Ig抗体结合。如标本中无sIgE，酶标抗体不能结合在检测区相应过敏原区带上。通过洗涤去掉未结合的标记物，然后加入底物显色。通过显色区带确定血清中含有哪种sIgE，进而判断待检者对哪种过敏原过敏。
实验材料 1. 检测条 包被有特异性过敏原的NC膜 2. 碱性磷酸酶标记的抗人IgE 3. 标本稀释液 4. 碱性磷酸酶底物 5. 浓缩洗液（10X） 洗液按照1:10倍稀释 6. 标本 待测血清用标本稀释液按照1:10倍稀释。
操作步骤 稀释好的洗液将检测条要充分浸透，放在摇床上摇10分钟 倒掉洗液，加入稀释好的测试者血清，放于摇床室温反应1.5小时 倒掉小槽中的血清，依次加入洗液，震荡10分钟，重复三次 每槽加入碱性磷酸酶标记的抗人IgE，放于摇床上室温反应30分钟 将碱性磷酸酶标记的抗人IgE倒掉，用洗液洗三次，每次10分钟 加入碱性磷酸酶底物，放于摇床，避光反应约10分钟 去掉底物溶液，用纯水洗三次，每次5分钟 将检测条放在干燥纸上，等检测条完全干燥后判定检测结果
注意事项 1. 不同批次的组分不可混用，且只能在效期内使用。 2. 检测标本只限于人血清、血浆。 3. 如果样本在3天内检测，可以保存在2~8℃，否则应冷冻保存，避免反复冻溶。 4. 如果标本含有不溶物，离心去除。溶血、浑浊或含有叠氮钠的标本不可用。 5. 加样器枪头不可混用，避免交叉污染。
结果分析 通过显色区带确定血清中含有哪种sIgE，进而判断待检者对哪种过敏原过敏。 临床意义 slgE测定是体外检测变应原的重要手段，主要用于Ⅰ型超敏反应的诊断。该检测条包被有多种特异性过敏原，通过检测血浆（血清）中过敏原slgE，筛查待检者对何种过敏原过敏，为临床进行脱敏治疗奠定基础。
小结和讨论 1.人类I型超敏反应可表现为全身性超敏反应和局部性超敏反应两种。 2.在5类免疫球蛋白中，IgE是血清中含量最低，半衰期最短，分解率最高，对热最不稳定的Ig。而在I型超敏反应患者体内，IgE含量显著增高。 3.血清总IgE的含量是由各种抗原IgE的总和决定。正常人血清IgE含量极微，约0.1～0.9mg/L水平。临床上一般采用敏感性较高、稳定性较好的化学发光免疫测定法、酶联免疫测定法进行检测。
思考题 1. 测定血清sIgE的方法有哪些？各有何优缺点？ 2. 测定血清sIgE的临床意义？
一、直接Coombs试验（试管法） 实验目的 1.掌握直接Coombs试验的原理和操作方法。 2.熟悉Coombs试验的临床意义。
实验原理 ＋ 患者红细胞 Coombs试剂 检测红细胞上不完全抗体
实验材料 1.诊断试剂 抗球蛋白试剂； 2.待测患者红细胞； 3.生理盐水、小试管、吸管、离心机等。
操作步骤 用生理盐水配5%红细胞悬液 取洁净小试管2支，1管加1滴5%红细胞悬液，另一管加生理盐水作对照 在生理盐水和5%红细胞悬液中分别加入诊断试剂一滴，使其混匀，室温稍待片刻 1000r离心1 min或3000r离心15s。 取出试管先以肉眼观察有无溶血，再轻轻摇动试管，如有凝集，则为阳性结果；如无凝集，应在室温延长15~30 min的反应时间，再离心看结果。
注意事项 1. 每次试验均须设阴、阳性对照，如阴性对照发生自凝，实验无效。 2. 受检血标本必须新鲜。 3. 洗涤后的红细胞和器材都不能残留有血浆蛋白，以免出现假阴性。 4. 操作过程中动作轻柔，特别是观察反应结果时，应轻轻摇动试管，不可用力过大。 5. 判定结果时，溶血与凝集有同样意义。 6. 试验后应将玻片即时放入消毒缸内。
结果分析 生理盐水对照不应发生凝集，为均匀浑浊的乳状液。在红细胞悬液中，如红细胞凝集成片状，边缘皱褶如花边状或边缘松散为阳性。如与对照相同，为阴性。
临床意义 直接Coombs试验用于检测患者红细胞上不完全抗体，Coombs试验阳性可见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血病、某些高球蛋白血症患者，如系统性红斑狼疮、类风湿、恶性肿瘤等。 思考题 直接Coombs试验的原理及临床意义？
二、间接Coombs试验（微柱凝胶法） 实验目的 1.掌握间接Coombs试验的原理和操作方法。 2.熟悉Coombs试验的临床意义。
实验原理 患者血清 靶红细胞 致敏红细胞 Coombs试剂 检测血清中的抗红细胞抗体
实验材料 1. 微柱凝胶卡 内含抗球蛋白试剂； 2. 筛选红细胞 一般由2~3人份O型红细胞组成一套试剂 3. 待测患者血清； 4. 生理盐水、小试管、吸管、试管架、离心机、温箱等。
操作步骤 撕开微柱凝胶卡密封纸，标记 加1%筛选红细胞50μl及受检者血清25μl 37℃孵育15min 离心机离心10min，1000r/min 观察结果，如红细胞悬浮在反应管顶部或凝胶中，则为阳性结果；反之，如红细胞沉于凝胶底部（管底尖部），则为阴性结果。
注意事项 1. 反应卡封口有损坏，管中干涸或有气泡时，不可使用。使用前必须清楚标记试剂卡,一定要空离心一次后备用。 2. 不要将试剂卡长期保存4℃，在此温度下，试剂卡中液体蒸发凝集于封口铝箔下，胶易干涸，应将试剂卡保存在18~22℃。 3. 细胞浓度为0.8%~1%，浓度过高或过低，均可减弱凝集强度。 4. 纤维蛋白可吸附部分红细胞，导致假阳性结果。 5. 细菌污染、不适宜储存或过期都能使试剂失效。 6. 须设阴、阳性对照。 7. 微柱凝胶管中出现溶血现象，特别提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其它原因所致溶血，对此标本一定要认真分析。
结果分析 反应格局及判断标准 - 100%的红细胞沉在微管的底部 +/- 100%的红细胞沉在微管的下端1/3之内 1+ 80%的红细胞沉在微管的下端2/3之内 2+ 80%的红细胞沉在微管的上端2/3之内 3+ 80%的红细胞沉在微管的上端1/3之内 4+ 凝集的细胞全部处于微管的顶部 d.p. 双群 Hemo. 溶血
临床意义 间接Coombs试验用于检测患者游离血清中的不完全抗体。此实验多用于检测母体Rh（D）抗体，以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生，亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。
小结和讨论 1.检测抗红细胞不完全抗体的常用方法为抗球蛋白试验，又称为Coombs试验，直接Coombs试验用于检测患者红细胞上不完全抗体；间接Coombs试验用于检测患者游离血清中的不完全抗体。 2.Coombs试验阳性可见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血病、某些高球蛋白血症患者，如系统性红斑狼疮、类风湿、恶性肿瘤等。
思考题 1.新生儿溶血症发生的机制是什么？ 2.微柱凝胶免疫试验可能出现的结果有哪些，试分析原因？
实验目的 1.掌握PEG比浊法检测循环免疫复合物的原理和方法。 2.熟悉循环免疫复合物检测的临床意义。
实验原理 本试验是检测抗原非特异性循环免疫复合物的一种方法。PEG是环氧乙烷和水的多聚物，为一种不带电荷的直链大分子多糖。终浓度为3%～4%的PEG能相对选择性地沉淀CIC。用分光光度计测定浊度，反应沉淀物含量。
实验材料 1.pH8.4 0.1mol/L 硼酸盐缓冲液（BB） 硼砂4.29g、硼酸3.40g，蒸馏水加至1000ml，溶解后用G3或G4号玻璃滤器过滤； 2.PEG-NaF稀释液 PEG6000 40.0g、NaF 10.0g、BB加至1000ml，溶解后用G3或G4号玻璃滤器过滤； 3.待检血清、微量加样器、试管、吸管及橡皮滴头等； 4.分光光度计。
注意事项 1.4%PEG能沉淀较小的CIC，2%PEG只能沉淀较大的CIC，但浓度大于5%，PEG选择性沉淀CIC的特性即行消失，导致假阳性的出现。 2.应注意实验温度变化对结果的影响，离心速度与时间也应严格掌握。 3.低密度脂蛋白可引起浊度增加，故应空腹采血。 4.高γ球蛋白血症以及血清标本反复冻融，均易造成假阳性。
结果分析 待检血清浊度值=（测定管吸光度-对照管吸光度）×100，以大于正常人浊度值均值加2个标准差为CIC阳性。 参考值： 正常人血清CIC的A值为4.3±2.0，以≥8.3为免疫复合物阳性。
临床意义 循环免疫复合物（Circulationimmunecomplex，CIC）又称可溶性免疫复合物，分子量为50万～100万，沉降系数8.8～19S，它不易被吞噬细胞吞噬，又不能经肾小球排出，可较长时间在血液中循环，一旦大量循环免疫复合物沉积于组织中，则引起组织损伤及相关的免疫复合物病。 CIC阳性常见于： 1. 部分自身免疫性疾病，如SLE，类风湿关节炎等； 2. 膜增殖性肾炎，链球菌感染后肾炎； 3. 传染病，如慢性乙型肝炎，疟疾，麻风等； 4. 恶性肿瘤。
小结和讨论 1.循环免疫复合物的检测有助于辅助诊断某些免疫复合物疾病，如血清病、SLE、慢性活动性肝炎时，CIC往往较高；此外，对CIC的动态检测有助于监视某些疾病的发展，协助判断疗效和预后；有助于探讨研究III型变态反应疾病的发病机制。 2.此法快速简便，但特异性较差，仅适于筛选。CIC检测方法较多，原理各不相同，结果也不尽一样，因此最好采用多种方法同时进行，以提高阳性检出率。由于在病理状态下往往是单一种类抗原抗体复合物增高，这种增高只有达到影响总CIC水平才能被检出，所以有时检测抗原特异性CIC更为重要。
思考题 循环免疫复合物检测的临床意义？
实验目的 通过病案讨论、提出问题、应用免疫学技术检测有关免疫学指标，将免疫学技术应用于临床实践，对临床疾病做出诊断或医疗建议，进而对有关问题产生深入研究的学习动机。
病案讨论一 患者王X，女28岁。因上呼吸道感染前来我院就诊。按医嘱作青霉素皮试阴性，给静滴青霉素800万U加5%GNS250ml。患者上午9点左右开始输液，约1点40分左右输液毕，无任何不适反应，下午3点左右患者感觉全身不适，似有好多虫子、蚂蚁在身上爬，全身紧困，随即出现心慌等不适前来复诊。一般尚可，痛苦面容，测BP100/70mmHg、P128次/分、心电监护提示频繁室早、R30次/分、明显缺氧症。遵医嘱给肌注肾上腺素1ml，5%GNS250ml，地塞米松10mg静滴；第二组10%GNS250ml ，利多卡因100mg，给氧等处理后症状仍无明显改善转入入院治疗，入院后给抗过敏、抗心律失常治疗，一周后病人自觉症状消失，痊愈出院。 问题： 1.该患者有可能属于哪型超敏反应？ 2.如何进行免疫学诊断？
