Anatomía Vegetal 2006. Natalia Almasia Ariel Bazzini Guillermo Maroniche Mariana Massó

2. Rol de WUSCHEL en la regulación del destino de las células stem en el meristema apical de Arabidopsis. Anatomía Vegetal 2006. Natalia Almasia Ariel Bazzini Guillermo Maroniche Mariana Massó Vanesa Mongelli Diego Zavallo

3. Introducción • Durante los primeros estadíos del desarrollo de las plantas con semilla, todas las células tienen la capacidad de dividirse, son pluripotentes. • Luego, sólo algunas partes permanecen con esa capacidad: los meristemas.

4. Post- embrión: el SAM desarrolla una roseta de hojitas. Aparece el meristema axilar. Se forma el meristema floral. Floral y apical del tallo: regulación génica similar. Apical: crecimiento ilimitado. Floral: termina con el gineceo. Introducción

5. Stem Cells Zona Central Centro Organizador L1 = túnica L2 = túnica L3 = corpus Zona Periférica Zona de Transición

6. Organización del meristema Epidermis Tejidos internos Todos derivan de 1 a 3 células que componen cada capa germinal

7. Meristema del tallo • La integridad se debe mantener durante: • Proliferación celular, • Iniciación de organogénesis, • Formación repetida de órganos. CLV STM + - ORGANOGÉNESIS

8. ¿¿Especificación de las stem cells?? • Se da por la información posicional • Se impone en las células que residen en la cumbre del meristema apical; • Más allá de esta posición, se diferencian. • Protagonismo de “WUSCHEL”?

9. W.T

10. W.T W.T Mutantes wus

11. Meristema Apical del Brote Meristema Floral Células pierden la especificación “stem” Pero tampoco constituyen órganos... WUS especificaría que el destino de las células es mantenerse como STEM (en lugar de reprimir la formación de órganos) Mutantes wus

12. Wuschel • Análisis molecular de WUS? • Rol en los meristemas del brote y florales? • Cómo se forman y mantienen los meristemas durante el desarrollo?

13. RFLP YAC Cosmidos Fig 2.A.Positional cloning. Caminado cromosomico

14. Restriction Fragment Lengh Polimorphism (RFLP) wus wt X

15. HindIII wus Cósmidos 6,8 y 9 COMPLEMENTACION Transgénicas para los distintos cósmidos SIN COMPLEMENTACION Región complementaria al 6, 8 y 9 cDNA library Open Reading Frame (ORF) de 873 pb

16. TATA box CCAAT box etc polyA 5´RACE wus DNA binding Homeodomain Acid domain wus-1 cambian los bordes de un intron/exon y resulta en codon stop = Mutante FUERTE wus-3 sustitución de aa =Mutante DEBIL. wus-2y4 codon stop =Mutante FUERTE

17. Clásica estructura

18. GUS GUS WUS GUS GUS WUS Localización subcelular de WUS?

19. Expresión de WUS durante el desarrollo del embrión 8 células 16 células +16 células

20. Expresión de WUS durante el desarrollo del embrión 32 células E. transición E. corazón C. L. de E. corazón

21. L1 L2 L3 Expresión de WUS durante el desarrollo del embrión Estadio tardío Control (sonda sense)

22. WUSCHEL y SHOOTMERISTEMLESS (STM) se expresan independientemente WUS STM STM Embrión wusEstadio tardío Embrión stmEstadio tardío Embrión wtEstadio tardío

23. Conclusiones • WUS posee localización nuclear • Se expresa durante la embriogénesis, a partir del estadio de 16 células, incluso antes de que exista un meristema apical diferenciado. • Posteriormente, su expresión se localiza en el meristema apical del tallo por debajo de las capas L1 y L2. • La expresión de WUS y STM se inician independientemente

24. Expresión del mRNA de WUS durante el desarrollo post-embriogénico Hipótesis: su expresión es requerida en las células centrales de los meristemas Meristemas de inflorescencia (im): WUS debajo de L3. Meristema floral: WUS confinado a un pequeño grupo de células en el centro por debajo de las L2 Meristemas vegetativo: WUS confinado a un pequeño grupo de células en el centro por debajo de las tres capas celulares más externas(L1-3) sépalo Primordios foliares sépalo Meristemas floral: emergiendo como un pequeño bulto (1 y 3) Meristemas de inflorescencia: en estadio 1 y 2 de la formación del meristema floral, mostrando expresión de WUS en el centro. Estadio 2 floral: WUS fuertemente detectado en un grupo de células por debajo de L2. Meristema floral desarrollando en forma de “cúpula”. pedicelo hoja caulinar

25. Expresión del mRNA de WUS durante el desarrollo post-embriogénico Estadio 10 se inicia la formación de primordios carpelares (ca): el meristema es consumido y la expresión de WUS es indetectable. Estadio 6 floral: sépalos (s), pétalos (pt) y estambres (st) formándose en la periferia, expresión de WUS reducida. Meristema vegetativo (plántula): Control negativo Tinción no detectada. Estadio 2 y 3 de flor: Control negativo Tinción no detectada. A diferencia del meristema vegetal, el floral es reclutado por las células centrales durante la organogénesis, a continuación la expresión de WUS es regulada negativamente, consistente con el rol de las células que expresan WUS en el destino de ser “stem Cells”. Dado que WUS se detectó en capas diferentes en el meristema floral comparado con el vegetativo y el de la inflorescencia, esto sugiere que si bien son estructuras homólogas que comparten mecanismos, ambos meristemas están, en parte, organizados diferencialmente.

26. Zona Central Rol de WUS en el meristema del tallo En la parte inferior de la zona central se expresa WUS WUS define un nuevo dominio funcional dentro del meristema: el centro organizador. Mantienen a las células que están por arriba, como STEM cells.

27. Stem cells rodeadas por un grupo de células activas mitóticamente: el centro organizador. Este centro promueve el estado stem en las células vecinas. Stem cells rodean un grupo de células que no se dividen: el centro quiescente. Este centro inhibe la diferenciación de las células stem vecinas. SAM RAM En ambos meristemas, las células stem son especificadas por un “centro organizador” central. Modelo básico para especificar el estado pluripotente de las células stem Interacciones entre células vecinas

28. Dinámica del patrón expresión de WUS durante la embriogénesis temprana

29. Conclusión • La formación del MAT es el resultado de una sucesión de procesos que comienza en la embriogénesis temprana. • Una vez establecido el MAT, la expresión de WUS define un grupo de células cuya función es especificar la identidad de las células vecinas como meristemáticas (STEM).