UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA - PowerPoint PPT Presentation


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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-LABIOEX. Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT. Ms. Karina Bettega Felipe. Florianópolis, maio de 2011. 1. Princípio. 2. Amostra.

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Presentation Transcript

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-LABIOEX

Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT

Ms. Karina Bettega Felipe

Florianópolis, maio de 2011



2. Amostra

  • Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo.

3. Reagentes/soluções/suspensão celular

  • Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de antibióticos penicilina 10.000u/mL e estreptomicina 10.000µg/mL (1%);

  • Solução de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL

  • Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de meio de cultura completo


4. Procedimento

  • Preparar uma suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL:

  • a) Retirar o meio de cultura da garrafa


b) Lavar a garrafa com PBS

c) Adicionar a tripsina


d) Esperar a tripsina reagir

e) Preparo do meio de inativação


f) Inativar a tripsina

g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon


h) Centrifugar as células

i) Retirar meio com tripsina



k) Contar as células

Nº céls/mL= nº céls contadas/4 x diluição da câmara X diluição amostra

Nº céls /mL=nº céls contadas/4 x 104 X 10


l) Preparar suspensão 0,5 X105 células por mL

  • 200 µl/ poço X 96 poços = 19,2 mL

  • Contagem de células: 5 X 105 células/mL

  • Número de células necessárias:

  • 0,5 X105 células – 1000µl

  • X - 19200µl

  • X= 9,6 X105 células

  • Quantos µl da suspensão celular terá 9,6 X105 células?

5 X105 células – 1000µl

9,6X105 células- X

X= 1920µl


5 X105 células – 1000µl

0,5 X105 células - X

X= 100µl

100µl (0,5 X105 células) – 1000µl

X - 19200µl

X= 1920

  • Suspensão utilizada para o teste:

  • Precisaremos de 19.200

1920µl de soro

192µl de antibiótico

1920µl da suspensão celular

15168µl de meio

µl


  • Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço


24h

Retirar o meio de cultura

24, 48 ou 72 h

TRATAMENTO


Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL)

1000µL

1000µL

1000µL

200µL

Solução mãe

(1000µg/mL)

100µg/mL

1800µL meio

12,5µg/mL

1000µL meio

50µg/mL

1000µL meio

25µg/mL

1000µL meio

1000µL

1000µL

6,25µg/mL

1000µL meio

3,125µg/mL

1000µL meio


CTRL

100

50

25

12,5

6,25

3,125

CTRL

100

50

25

12,5

6,25

3,125

100

50

25

3,125

CTRL

12,5

6,25


24h

Retirar o meio de cultura

24, 48 ou 72 h

TRATAMENTO


O que vocês vão fazer!!!

Preparar solução MTT

Retirar o meio

Lavar os poços 2X com PBS

Adicionar DMSO

5’

2h

Estabilização da cor

540 nm

5’


  • Preparo da solução estoque a 5mg/mL

  • Pesar 5mg de MTT

  • Solubilizar em 1,0 mL de PBS estéril.

  • b) Preparo da solução de uso (0,5mg/mL)

  • CV=CV

  • 5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL

  • V= 1mL da solução estoque

  • + 9mL de meio completo

900µl de soro + 90µl de antibiótico + 8010µl de meio


O que vocês vão fazer!!!

Preparar solução MTT

Retirar o meio

Lavar os poços 2X com PBS

Adicionar DMSO

5’

2h

Estabilização da cor

5’

540 nm


Descontar o branco !

Considerar o controle como 100% de células viáveis e fazer regra de três para determinar a viabilidade celular das amostras

Fazer a média da absorbância


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