基因扩增检验专业现场评审方法和技巧

1. 基因扩增检验专业现场评审方法和技巧 医学实验室评审员持续培训/ 评审组长同级转换培训班 上海 2009-4-25~26

2. 现场评审的基本思路 基因扩增检验实验室均经过卫生部临床检验中心的技术验收，验收标准又基本参照了ISO15189认可准则的要求，所以，在评审准备要实验室提供验收合格证书 日程安排上不能因通过了技术验收而忽视了PCR实验室的认可 重点关注申请的项目是否都有批文、各项记录是否完善等内容

3. 常见不符合项举例及分析 HBV-DNA可报告范围为103－108，HCV-RNA可报告范围为103－107，标准曲线和室内质控的浓度设定都在104以上，建议观察103低浓度值。 有一位从事临床基因扩增检验工作人员未获得培训合格证书

4. 分区

5. 现场评审的重要环节 • 检验前程序（PCR技术验收表6－－标本管理） －－验收表比较简单，应注意RNA、分泌物等标本的采集、运输和保存 • 检验程序（见后） • 检验后程序（注意TAT是否满足质量目标的要求；报告单所必须包含的内容） • 座谈会（要了解临床对定量HBV-DNA；性病检测）

6. DNA、RNA的保存 DNA标本无菌条件2-8℃保存不超过3天，超过3天- 20 ℃ 。标本长期保存应在-70℃。避免多次反复冻融。DNA在TE缓冲液中（10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，PH 8.0），4℃储存6个月以上，其中EDTA还可抑制微生物生长。 RNA容易降解，操作和储存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高压灭菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的蒸馏水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制剂（RNasin）， 终浓度为2U/10μl，置-20℃保存备用。冰块上操作为宜。

7. 其他标本 • 棉拭子 －－生理盐水充分振荡洗涤、静置5～10min、取上清、离心、沉淀物提DNA。如不立即提取，存－70℃ • 脓液 －－沉淀标本的保存同样为－70℃ • 体液 －－沉淀标本的保存同上

8. 检测系统 • 校准（加样器、温湿度计、扩增仪） －查看文件与实际校准的情况 频度：首次（新安装）； 后续（主要部件维修，强制周期如 每年，不定期） PCR仪：温度准确度及升降速率；荧光本底；激发及吸收波长的准确度、杂闪光、重复性、线性

9. 检测系统 • 比对－－没有开展室间质评的项目；比对的结果 • 性能验证－－新启用的设备 • 维护保养 －－保养程序、操作手册 严格按照仪器使用手册编写， 包括日、周、月、季、半年、年 －－标识（时间、名称） －－记录

10. 现场评审的关注点 检测系统 室内质控 室间质评 溯源及测量不确定度 现场试验 人员能力 检验前程序观察 检验报告 生物安全 座谈会

11. 室内质控 • 采用一系列统计学的方法连续地评价检测工作的可靠程度，判断检验报告是否可以发出的过程 • 目的是控制本实验室测定工作的精密度，监测其准确度的改变，提高常规检验工作的批间、批内标本检测结果的一致性 • 室内质控规则的制定是否合理（质控图、质控水平、质控频率） －－每次现场验收问题最多的地方

12. 室内质控 • 质控目的：假阴性、假阳性，准确性、精密度 • 质控点：样本质量、模板提取、扩增效率 • 质控物安排：空白、阴对、弱阳对、标准品 • 控制范围：空白、阴对-------阴性 弱阳对-------阳性（上下一次方） 标准品-------r值（ - 0.998） 斜率（-3.1--- -3.5） 截距（﹥40左右；达安﹥ 30） 点间CT值 （3.3左右）

13. 如何确定阈值 基线的作用（Baseline cycles ） 消除检测中背景荧光信号的影响，确定阈值 基线的范围：仪器一般默认的范围（应根据试剂合要求） PE-5700 、PE-7000 3-15 iCycle 2-10 LightCycle 3-12 基线需根据实验结果进行适当调整：延长基线以包括最高浓度样本扩增曲线起跳前尽可能多的循环，可以使扩增曲线更平滑、数据也得到一定改善。

15. 阈值线 荧光阈值线的调整 需根据实验结果进行适当调整 1、落在阴性对照线最高点上方 2、外标准扩增曲线的均一位置（点间CT3.3左右）3、尽量接近扩增曲线刚真正进入指数扩增期的位置（避免弱阳性漏检以及一些扩增反应影响因素在指数期的放大）

16. Threshold Cycle Calculation: Baseline cycles Through Threshold Position 2 14 20.8

17. 标准曲线 通过基线和荧光域值线的调整应达到： 相关系数（ r值） ≥0.998 斜率 -3.0 ----3.5 截距 -40±4 （这些参数根据仪器和试剂有所不同）

22. 室间质评 参加卫生部及省内质评计划 原始记录及结果报告 室间质评结果分析报告（如果没有分析报告，应该开观察项还是不符合项？开在哪一条？） 不符合项（原因分析及整改措施有效性）

23. 溯源及测量不确定度 检测系统配置的基本情况 溯源性确认的基本原则 不能溯源时，结果可靠性的确认原则 测量不确定度（评审把握的尺度、具体举例）

24. 现场试验 现场试验选择的原则 现场试验的方式（人员比对） 现场试验结果分析和判定 盲样试验的基本要求

25. 人员能力 评审方式（查看技术人员档案、提问、现场试验、现场操作） 理论知识（防污染知识、生物安全知识） 技术能力 问题处理（发现问题、分析问题和解决问题的能力）

26. 座谈会 座谈的原则与技巧（了解、关注临床新技术新进展） 关注的关键问题（明确几个必问的与专业相关的问题）

27. HBV DNA与肝细胞癌和肝硬化发生危险升高相关 REVEAL: 长期随访台湾未治疗的HBsAg阳性个体 50 随访13年 累积肝细胞癌的发生率[1] (N = 3653) 随访13年 累积肝硬化发生率[2] (N = 3582) 40 36.2 30 23.5 患者(%) 基线HBV DNA (拷贝/mL) 20 14.9 12.2 9.8 10 5.9 4.5 3.6 1.4 1.3 0 100,000- 999,999 ≥ 1 million 300- 999 1000- 9999 10,000- 99,999 300- 9999 < 300 ≥ 100,000 < 300 10,000- 99,999 1. Chen CJ, et al. JAMA. 2006;295:65-73. 2. Iloeje UH, et al. Gastroenterology. 2006;130:678-686.

28. HCC 病死率与基线HBV病毒载量的关系 1.00 HBV DNA (-) 0.96 HBV DNA Low (+) RR=1.8 (0.5–5.8) 0.92 Survival distribution function 0.88 HBV DNA High (+) RR=9.9 (3.2–31.0) 0.84 Survival time (years) 0.80 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Chen G et al. 55th AASLD Boston, Nov 2004; Poster 1362

29. 慢性乙肝病死率（除外HCC）与基线 HBV病毒载量的关系 HBV DNA (-) 1.00 HBV DNA Low (+) RR=1.5 (0.2–11.8) 0.96 0.92 HBV DNA High (+) RR=13.4 (1.9–97.1) Survival distribution function 0.88 0.84 Survival time (years) 0.80 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Chen G et al. 55th AASLD Boston, Nov 2004; Poster 1362

30. 小结 技术验收不能替代现场评审 PCR检测手工操作多、过程复杂、技术要求高、人员素质也应该高 对评审员的要求也高

31. 谢谢！