Laboratorio Integrato II

1. Laboratorio Integrato II Modulo di Biochimica

2. Programma delle esercitazioni • Determinazione della costante di affinità dell’eme per la sieroalbumina umana • Separazione di proteine in miscela mediante cromatografia a scambio ionico

3. Determinazione della costante di affinità dell’eme per la sieroalbumina umana

4. Stechiometria: numero di ligandi per proteina • Affinità: stabilità relativa del complesso. Descritta dalla costante termodinamica di equilibrio

5. P + L PL

9. La concentrazione di proteina deve essere dell’ordine di grandezza della Kd

11. Io I Sorgente Campione Monocromatore Ricevitore Misura dell’assorbimento

12. Monocromatore

15. Separazione di proteine in miscela mediante cromatografia a scambio ionico

16. Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico RIVELATORE

17. Valvole di iniezione L’interfaccia universalmente utilizzata per introdurre il campione è la valvola a 6 (o 7) vie. A seconda del loopmontato varia il volume del campione iniettato in colonna

18. Rivelatore UV a l fissa La radiazione proveniente da una lampada a vapori di Hg passa attraverso la cella del campione e arriva al fotodiodo. L’intensità della luce assorbita è proporzionale alla concentrazione dell’analita. Vantaggi e svantaggi Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254/280 nm. Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a l fissa.

19. Cromatografie di adsorbimento • Interazione idrofobica • Scambio ionico • Per affinità • Affinità per ligandi (anticorpi) • Proteine ingenierizzate (His-tag) • Immobilized Metal ion Affinity Chromatography

20. Coefficiente di partizione - a • Il coefficiente di partizione tra le due fasi, a, è definito come il rapporto tra il soluto adsorbito sulla fase stazionaria rispetto a quello in soluzione nella fase mobile. a = 0 nessun adsorbimento a = 1 tutto adsorbito

21. Cromatografia di scambio ionico • Scambio anionico • A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. • L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare). • Scambio cationico • A pH minore del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. • L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH.

22. Scambiatori ionici

23. Cromatografia di scambio ionico

26. VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali. Cromatografia di scambio ionico

27. All’esame… • Il candidato descriva l’esperimento atto a determinare la costante termodinamica di dissociazione della emoverdina (che assorbe a 460 nm, ε = 1×105 cm-1 M-1) con la HSA sapendo che in letteratura è riportato che lo stesso ligando si lega all’albumina bovina con Kd ≈ 10-6 M.

28. All’esame… • Descrivere un protocollo di purificazione di una proteina avente pI = 9.8 mediante cromatografia di scambio ionico, sapendo che la maggioranza delle proteine presenti nel campione possiede pI compreso tra 5 e 8.