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Elodie Laine

Analyse de l’Activation du Facteur Oedémateux de Bacillus anthracis par la Calmoduline, en vue de la Recherche d’Inhibiteurs. Elodie Laine. Dr. Th é rèse Malliavin Dr. Arnaud Blondel Ecole doctorale iVIV , Université Pierre et Marie Curie

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  1. Analyse de l’Activation du Facteur Oedémateux de Bacillusanthracispar la Calmoduline, en vue de la Recherche d’Inhibiteurs Elodie Laine Dr. Thérèse Malliavin Dr. Arnaud Blondel Ecole doctorale iVIV, Université Pierre et Marie Curie Unité de Bioinformatique Structurale, Institut Pasteur (M. Nilges)

  2. Contexte biologique La bactérie Gram+Bacillusanthracisest l’agent pathogène du charbon (anthrax). • 3 formes de contamination • cutanée (plaie) • intestinale (ingestion) • pulmonaire (inhalation) Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Liddington et al. 2002 B. anthracis a la particularité de former des spores très résistantes, qui se propagent facilement dans l’air et dans l’eau (risque bioterroriste). Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  3. Facteur oedémateux La virulence de B. anthracisest associée à : 1 capsule + 2 toxines (PA-EF/LF) Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion • PA : antigène protecteur • LF : facteur létal • EF : facteur oedémateux Translocation Activation par CaM Production d’AMPc Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 3

  4. Le complexe EF-CaM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Drum et al. 2002 (1K8T) Drum et al. 2002 (1K93) EF CaM EF-CaM + S1 S2 N-CaM Calmoduline • Senseur du calcium • 148 résidus, très flexible • 2 lobes + 1 linker central S4 C-CaM S3 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  5. Architecture du complexe Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hel N-CaM SC SB CB C-CaM CA SA Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  6. Problématiques • Questions biologiques : • Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM • rôle des ions calcium • mécanismes de l’interaction protéique • organisation du réseau de résidus • Mobilité structurale de la protéine EF • large transition conformationnelle • relation avec la fonction enzymatique • recherche rationnelle d’inhibiteurs de la toxine • Méthodes : • Simulations de dynamique moléculaire • Détermination de chemin de réaction • Criblage virtuel & validation expérimentale Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  7. Plan Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  8. Plan Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  9. Influence du calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Affinité de la calmoduline pour le calcium Ulmer et al. 2003 S2 S1 Drum et al. 2002 (1K93) N-CaM C-CaM S4 S3 Le niveau de calcium influence la stabilité, voire la formation, du complexe EF-CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  10. Simulations DM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Simulations de dynamique moléculaire (DM) - 15 ns Superposition de 4Ca-CaM + phase d’équilibration sous contraintes 1k93-2Ca 1k93-4Ca 1k93-0Ca • champ de force AMBER (ff99), thermostat de Berendsen, PME Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  11. Analyse de convergence - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Lyman & Zuckerman 2006 Sur l’ensemble de la trajectoire 1) conformation tirée au hasard 2) retrait des conformations à moins de r = 2.5 Å structures de référence 1eremoitié 2ememoitié 3001-9000 9001-15000 Sur chaque moitié de trajectoire Chaque conformation est associée à la structure de référence la plus proche groupes de référence Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  12. Dérive conformationnelle Déviation par rapport à la structure initiale Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Population des groupes de référence La trajectoire 1k93-2Ca présente la plus petite dériveconformationnelle et un bon critère de convergence. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  13. Plasticité de CaM Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de CaM le long des trajectoires Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  14. Plasticité de CaM Mode ACP de plus forte amplitude Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion + Ca2+ - Ca2+ 1k93-2Ca 1k93-4Ca 1k93-0Ca Les mouvements de CaM sont plus collectifs et plus indépendants avec 0 ou 4 Ca2+. CaMagit comme un ressort qui maintient EF en conformation ouverte active. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  15. La calmoduline et le calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion motif EF-hand Patchshydophobes fermé ouvert Chatt. et al. 1992 Zhang et al. 1995 Chattopadyaya et al. 1992 Meador et al. 1992 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  16. Coordination du calcium par CaM Nombremoyend’atomesd’oxygène coordonnant les ions calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion (distance à l’ion Ca2+ < 2.8 Å) Asp 3 Asn 5 Asp 1 Tyr 7 Glu 12 Site canonique La coordination des ions calcium est incomplète dans N-CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  17. Changements conformationnels de CaM Ouverture des motifs EF-hands Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion θ θ L’interaction avec EF requiertque C-CaMsoitouvert, chargé de calcium, et bloque N-CaM en conformation fermée. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  18. Structures cristallographiques Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1XFX 1K93 (EF) Hel (EF) Hel (CaM) (CaM) S2 S1 S1 S2 Drum et al. 2002 Shen et al. 2005 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 18

  19. Changements conformationnels de CaM Ouverture des motifs EF-hands Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion θ θ Mise en évidenced’une influence du réseau d’interactions entre EF et N-CaM sur l’ouverture des sites de fixation au calcium. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  20. Distances au calcium dans les sites Glu 12 Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Asn 5 Asn 5 Glu 12 Asp 3 S1 EF contraint directement S1 dans les deux systèmes 1k93 et 1xfx. Le réseau plus dense d’interactions entre EF et N-CaM dans 1xfx contraint indirectement S2. S2 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  21. Simulations LES «Locallyenhancedsampling» : augmenter la probabilité de dissociation du calcium en utilisant plusieurs copies de l’ion. Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1xfx 1k93 S2 P P P P P P C C C 1D 4D 8D 19D S1 P P P P C C C C 6D 16D 9D 22D 32D S2 P P P P P P C C C 10D 6D 29D 32D S1 P P P P C C C 4D 7D 17D 17D 29D 32D Copies 1 2 4 8 16 18 20 22 24 26 28 30 32 - CHARMM version 33b2 (200ps) • - potentielligand-protéineréduit - fonctionsigmoïdalediélectrique P : pas de dissociation C : dissociation commençante D : dissociation Leandro Martinez Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  22. Calculs d’énergielibre Cycle thermodynamique de disparition du calcium Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM a. Simulations b. Plasticité de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Intégration thermodynamique 1xfx 1xfx + ∆Gdiss(Ca2+/1xfx) (application d’une contrainte harmonique sur l’ion Ca2+) 1k93 1k93 + ∆Gdiss(Ca2+/1k93) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  23. Conclusion Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion • Stabilité de la forme EF-(2Ca-CaM) • en accord avec les données expérimentales • Modèle de l’interaction EF-CaM • exempled’une conformation inhabituellede CaM • Influence mutuelle EF-CaM / Ca2+-CaM • modulation par EF de l’affinité de CaM pour le calcium • Donnéesquantitatives de l’affinité de CaM pour le calcium • calculs d’énergielibre (FEP, TI) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  24. Plan Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  25. Architecture du complexe Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hel N-CaM SC SB CB C-CaM CA SA Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  26. Modèle de réseau élastique Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Bahar et al. (1997), Fold. Des. Réseau élastique Les Cα distants de moins de 9 Ǻ sont connectés par des ressorts. Lindahl et al. (2006), Nucl. Acids Res. Simulations DM (Pearson) La méthode ENM prédit correctement les fluctuations thermiques (0.90 < R² < 0.99), mais ne permet pas de distinguer les différents niveaux de calcium. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  27. Corrélations dynamiques - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Lange & Grubmüller(2006), Proteins Coefficient de corrélation généralisée Corrélations généralisées Information mutuelle Entropie de Shannon - mesure moins biaisée - rend compte des corrélations non linéaires Corrélations de Pearson Classification hiérarchique Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  28. Corrélations dynamiques Fluctuations atomiques et groupes de résidus Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b.Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca 100 non corrélés (< 0.5) moyennement corrélés (0.6 - 0.7) fortement corrélés (> 0.7) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  29. Définition de pseudo-domaines Corrélations résiduelles de la méthode LFA Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion N C Hel SC SA CA CB Les corrélations LFA permettent de redéfinir des pseudo-domaines. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  30. Influences énergétiques - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Srinivasan et al. (1998), J. Am. Chem. Soc. Méthode MMPBSA Entropie conformationnelle Modes Normaux Mécanique moléculaire Eint + Evdw + Eele Interactions polaires de solvatation Poisson - Boltzmann Interactions non polaires de solvatation Surface Accessible Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  31. Influences énergétiques - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hamacher et al. (2006), PloSComput. Biol. Cartes de dépendancesénergétiques Rang de réferenceRangref Calcule et range les énergies de liaison de chaquedomaine X au reste du complexe. Rangref 6 7 2 3 5 4 1 Rang-Hel 4 6 1 3 - 5 2 CA CB SA SC Hel NCaM CCaM Rang relatif Rang-Y Calcule et range les énergies de liaison de chaquedomaine X‘ au complexeamputé du domaine Y. Si Rang-Y (X') moins bon queRangref(X'), alors Y influence la stabilité de X' au sein du complexe. (intensité= nbde rangsperdus) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  32. Influences énergétiques Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion Hiérarchie relative de stabilité des domaines au sein du complexe 1k93-2Ca : centrées, équilibrées 1k93-0Ca : perted’influences 1k93-4Ca : plus diffuses * * * 1k93-2Ca * * * * * 1k93-0Ca 1k93-4Ca Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  33. Connexité du réseau de résidus Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques a. Réseau élastique b. Corrélations dynamiques c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion 1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca * * * * * * * * Influences énergétiques & corrélationsdynamiques La stabilité du complexe dépend de la connexité du réseau de résidus. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  34. Conclusion Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion • Architecture globale du complexe • modèle de réseau élastique • Dynamiqueglobaleet locale • groupes de résidus et domaines dynamiques • Connexité du réseau de résidus • propagation de l’information • Tests des modèles par l’expérience • protéolyse, fluorescence, mutations Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  35. Plan Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  36. Transition conformationnelle de EF Translation de 15 Å Rotation de 30° Boucle SB désordonnée Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Drum et al. 2002 (1K8T et 1K93) Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  37. Chemin d’activation de EF - méthode Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Détermination de chemin de réaction Arnaud Blondel Chemin : série de conformations qui ne sont séparées par aucune barrière énergétique. Fischer & Karplus (1992), Chem. Phys. Lett. • Premier jet : Simulations DM orientées • Cycle d’affinement : (i) réduction du nombre de conformations (ii) échantillonnage entre des paires de conformations, avec l’algorithme «ConjugatePeakRefinement» (CPR). Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  38. Chemin de transition Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  39. Analyse des mouvements de EF Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de EF le long du chemin Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Le chemin de transition de EF permet d’explorer des régions de l’espace conformationnel non atteignables par les simulations du complexe EF-CaM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  40. Identification de la poche Recherche systématique de poches Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion 122 Å3 Lee et al. (2004) ChemBiol. Site catalytique 933 Å3 102 Å3 SABC 450 Ǻ3 223 Å3 ICM PocketFinder – Trotov & Abagyan (2004), Genome Inform. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  41. Identification de la poche conf 1 Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Switch C Stratégie : Sélectionner des molécules capables de se fixer sur la poche SABC dans la forme inactive de EF et de maintenir sa forme, bloquant ainsi l’activation. Switch B conf 8 Switch A conf 28 conf 47 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  42. Outils de criblage virtuel Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Rarey et al. (1996), J. Mol. Biol. FlexX Placement du fragment de base Reconstruction incrémentale Abagyan et al. (1994), J. Comput. Chem. ICM Application du critère de Metropolis Configuration initiale Rotation/Translation aléatoire Rotation/Translation aléatoire E0 E1 < E0 E2 > E0 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  43. Approche in silico/ in vitro Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Criblage Virtuel Validation expérimentale ChimiothèqueNationale 28 000 mol. 1. Elagage S < m -  3500 mol. meilleur 1% Conformations intermédiairescommecontrôlesnégatifs. Sélection des meilleursligands. Tests enzymatiques 18 composés testés 30% inhibenttotalementl’activité de EF à des concentrations de 10-100 µM. Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  44. Tests enzymatiques CaM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion ATP EF I + activité enzymatique (1) I ATP CaM EF activité enzymatique (2) + (2) CyaA (1) F CH3-O diCl H Br Cl + + + + + + - - + - - - + + + - + + Inhibiteurs de l’activité de EF (Ki ~ 2-3 µM) Christophe Goncalves, Johanna Karst Daniel Ladant Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  45. Inhibition de CyaA Comparaison des structures de EF et CyaA Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Boucle SC / queue C-term Boucle SB / Boucle T300-K312 Boucle SA / Hélices F-G-H-H’ SABC de EF : 16 résidus 6 identiques, 5 similaires chez CyaA Guo et al. 2005 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  46. Inhibition de EF-CaM Analyse des poches à la surface de EF le long des trajectoires DM du complexe EF-CaM Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs a. Chemin d’activation b. Identification de la poche c. Criblage virtuel et tests Conclusion Poche résiduelle 104-326 Å3 Site catalytique Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  47. Conclusion Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion • Modélisation d’une transition complexe • conformations intermédiaires plausibles • Définition d’un site de liaison potentiel • stratégie innovante : cibler une poche allostérique • Identification d’inhibiteurs • nouvelle famille de composés, affinités de quelques µM • Caractérisation du mode de liaison des composés • résolution d’une structure co-cristallisée Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  48. Conclusion générale et perspectives Introduction I. Stabilité de l’interaction EF-CaM II. Aspects dynamiques énergétiques III. Recherche d’inhibiteurs Conclusion • Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM • modèle de l’interaction EF-CaM • influence mutuelle entre les interactions EF-CaM et Ca2+-CaM • modèle de l’effet du calcium sur le réseau de résidus • Mobilité structurale de la protéine EF • chemin plausible de transition conformationnelle • modulation de l’activité enzymatique par effet allostérique • identification d’une nouvelle famille d’inhibiteurs • Extrapolation à la toxine CyaA de B. pertussis • caractéristiques différentes de EF • mécanismes de l’activation par CaM • déterminants de l’affinité des inhibiteurs Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  49. Remerciements UnitéBiochimie des Interactions Macromoléculaires AlexandreChenal Johanna Karst Daniel Ladant Benjamin Bardiaux GiacomoBastianelli Aymeric Bernard Renée Communal Pak-Lee Chau Claire Colas Nathalie Duclert Julia Forman David Giganti Christophe Goncalves Tru Huynh Leandro Martínez(Brésil) Olivier Perin EditheSelwa EdouardYeramian Arnaud Blondel ThérèseMalliavin Michael Nilges Universidade Federal Fluminense JullianeYoneda B I S CERMN AurélienLesnard Sylvain Rault University of Chicago Wei-Jen Tang Claire Dane Gilles Vergnaud Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

  50. Equilibration 1k93-4Ca Distances de coordination du calcium dans S1 et S2 * : contraintes de distance de 10 kcal/mol/Å2 Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

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