乳胶增强法测定 C- 反应蛋白 的初步评价

1. 乳胶增强法测定C-反应蛋白的初步评价 毕业学生：谢嘉慧(广州医学院2000检本) 指导老师：易向民(广州市红十字会医院检验科)

2. 摘要 • 目的 ：初步评价乳胶增强法测定C-反应蛋白(CRP)的临床应用性能。 • 方法： 依据NCCLS颁布的《定量临床检验方法的初步评价；批准指南(EP10-A)》文件，按特定的顺序连续5天测定低、中、高浓度质控品中的CRP，对测定CRP的乳胶增强法进行初步评价。

3. 前言 CRP • C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）是一种急性感染时相反应蛋白。正常人血清中其含量极微，在各种急性感染、组织损伤等情况下，血清CRP含量可迅速升高，随病情缓解又迅速下降，恢复正常。近几年来，CRP可作为一项预测、诊断和预防心脑血管疾病较具重要价值的指标。许多前瞻性研究证实在已确诊的心血管疾病个体中，CRP是将来发生心血管疾病发病率和死亡率的预测指标。更大的临床价值是证实CRP是将来发生首次冠状动脉疾病的强有力预测指标。

4. 前言 • 测定CRP的方法 • 测定CRP常用方法有散射比浊法和免疫透射比浊法，目前用乳胶增强法测定CRP，是一种新的检测方法，我们参照NCCLS颁布的EP10-A文件所提供的实验设计与分析数据、分析步骤，对其进行初步评价。

5. 材料和方法 • 一、材料 • 1、仪器 　 日立7600全自动生化分析仪。 • 2、试剂 CRP试剂盒(批号:005RGB)； CRP校准液(CRP calibrator,批号:003RIB) 均由日本第一化学药品株式会社生产

6. 材料和方法 • 3、测定样品 　英国朗道公司定值液体质控血清 　将上述高值样品和低值样品等比混合为中值样品，CRP标定值52.3mg/L。

7. 材料和方法 • 二、方法 • 1、日常常规开机，保养，定标，质控。 • 2、按NCCLS EP10-A文件测定样品CRP浓度 • 顺序如下：中值、高值、低值、中值、中值、低值、低值、高值、高值、中值（第一个中值为测定起始用，不作统计）。 • 3、每天测定一批，连续测定5天，得到低、中、高值数据各15个。每批测定为连续测试，在测定过程中，后9个数据中的任何一个不及格（被拒绝、丢失或由于任何原因没有报告），都须弃掉该批全部数据，重新测定。 • 4、数据处理 • 所有数据采用Excel软件进行统计学分析

8. 材料和方法 • 三、结果的判断标准 • 总不精密度的接受范围 • 由于乳胶增强法测定CRP尚没有规定标准的允许不精密度，故我们以散射比浊法要求的允许不精密度小于5%来评价。 • 绝对偏差的接受范围 • 全国临床化学室间质评规定,特殊蛋白测定方法的可接受范围为靶值±3SD，本室设定CRP可接受范围为靶值±2SD，低、中、高各浓度的允许偏差范围（±2SD）分别为±2.42mg/L、±5.23mg/L、±8.04mg/L。

9. 结果 • 一、绘图及目测初评 • 1、目测离群点　见图1

10. 图1 离群点观测（偏差图）Fig.1 Inspection for outliers 结果显示：无离群点、精密度良好。

11. 结果 • 2、目测线性　　见图2

12. 图2 线性观测（均值连线图）Fig.2 Inspection for Linearity 图2 线性观测（均值连线图）Fig.2 Inspection for Linearity CRP ŷ=1.283+0.992x，r2=0.9999 ŷ=1.283+0.992x，r2=0.9999 • 结果显示：测定线与参考线几乎重合，线性良好且偏差较小。　

13. 结果 • 二、线性回归方程分析 • 根据最小二乘法原理，CRP测定的回归方程为ŷ=1.283+0.992x，确定系数r2=0.9999，回归较好。

14. 结果 • 三、多元回归分析 • 1、偏差分析结果 见表1

15. 表1 偏差计算（包括全部5天数据）Tab.1 Calculations of bias：all runs 注：*总均值是来自5天各水平测定均值的均值。

16. 结果 • 2、不精密度分析结果 见表2

17. 表2 不精密度计算（包括全部5天数据）Tab.2 Calculations of imprecision：all runs 注：*因每种数据个数相同(高、中、低各测3次)故可用各批内方差之均值作为总批内方差，即总批内方差=各批内方差之和÷5； **每日均值方差是来自表1的同一浓度水平的每日均值的方差； ***校正日间方差如小于零，可以零计。

18. 结果 • 3、多元回归分析小结 见表3

19. 表3 多元回归小结（包括全部5天数据）Tab.3 Multiple regression summary：all runs 注：表中，斜率的t值都大于4.6，因为这是和0相比，有统计学意义，即表明斜率与浓度变化高度相关；按EP10-A文件要求调整，用B1值除以标度因子(标度因子=[标示值(中)-标示值(低)]=52.3-24.2=28.1，每天多元回归计算值)，结果分别是0.996、1.002、0.995、0.992、0.977和1相比无统计学意义，即符合要求。

20. 结论 • 从以上结果可以看出：日立7600全自动生化分析仪对乳胶增强法测定CRP经用NCCLS EP10-A文件所提供的方法评价，其非线性、偏差、总不精密度及抗交叉污染能力均达到标准，符合临床应用要求。

21. 讨论 • EP10-A文件 • NCCLS颁布的EP10-A评价方案，主要用于评价临床实验室定量分析方法的线性、偏差和不精密度，可用于对自动分析仪、试剂盒、手工操作或其他临床体外诊断方法的初步评价。 • 特点：简便、实用，只需5天即可完成全部测试；所需时间和材料少，数据容易收集；通过作图分析和简单计算，结果一目了然；目测即可得到初步印象。

22. 讨论 • 利用特定的测试顺序，使不同浓度之间互相交错，比较接近临床病人标本情况，使得结果也更真实。再运用多元线性回归，可对影响精密度的因素（如携带污染、非线性、漂移等）进行进一步的分析。

23. 讨论 • 乳胶增强法测定CRP的检测原理和应用 • 原理：将抗人-CRP单克隆抗体包被于一种微小的颗粒(聚苯乙烯珠)上，标本中的CRP与颗粒表面包被的抗人-CRP抗体反应产生浊度，由全自动生化分析仪检测其浊度的变化；其浊度与标本中的CRP浓度呈比例，根据标准曲线，即可计算出标本中CRP的浓度。

24. 讨论 • 许多研究表明，对健康人群来说，CRP的参考范围应为<3mg/L。现测定CRP常用方法有散射比浊法和免疫透射比浊法，检测低限为4mg/L。因而不能很好地检测出健康人群低水平的CRP浓度变化。乳胶增强法是用聚苯乙烯粒子与特异性抗体共价交联以增强光散射信号的新检测方法，能应用于全自动生化分析仪，可以检测出低水平0.100mg/L CRP浓度，该水平已被证实可预报今后冠心病发病与否，可充分满足临床预警和实验诊断要求。

25. 讨论 • 综上所述，日立7600全自动生化分析仪对乳胶增强法测定CRP的非线性、偏差、总不精密度及抗交叉污染能力符合初步评价要求。

26. 感谢各位专家指导！