Isolasi Gen α -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 dengan Teknik Degenerate PCR dan Inverse PCR

1. Isolasi Gen α-Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 dengan Teknik Degenerate PCRdan Inverse PCR Fernita Puspasari

2. α-Amilase Hidrolisis ikatan -1,4glikosidik polisakarida Protein multidomain Aplikasi: makanan, detergen, kertas, tekstil, bioetanol amilosa -1,4-glikosidik dekstrin oligosakarida linier -1,6-glikosidik amilopektin maltosa glukosa

3. Industri Pengolahan Pati 105 oC 50-60 oC • Hidrolisis pati: gelatinisasi suhu ↑, biaya ↑ • -Amilase pendegradasi pati mentah: biaya ↓, menyederhanakan proses konversi pati. Suspensi pati sakarifikasi likuefaksi gelatinisasi α-amilase termostabil glukoamilase

4. Sampel Bacillus aquimaris MKSC 6.2 • Bakteri laut, berasosiasi dengan koral lunak Sinularia sp.  perairan P. Merak Kecil Identifikasi bakteri: penjajaran urutan nukleotida gen 16S rRNA

5. 1 hari 2 hari Kemampuan mendegradasi pati mentah 1 2 1: Bacillus aquimaris MKSC 6.2 2: bakteri yang tidak mampu mendegradasi pati mentah Media: marine agar plate+1% pati kentang mentah+KI/I2

6. Scanning Electron Microscopy 5 µm 5 µm 10 µm 10 µm 1 µm 5 µm 5 µm 10 µm 1 µm 10 µm singkong sagu kentang beras jagung

7. Belum ada informasi genom B. aquimaris Bagaimana mengisolasi gen α-amilase B. aquimaris Konstruksi perpustakaan genom (genomic library) PCR ?

8. Konstruksi Koleksi Genom Parsial

9. potong potong DNA vektor DNA genom Enzim restriksi Enzim restriksi ligasi Transformasi E.coli • Uji aktivitas • Hibridisasi DNA • Hibridisasi protein Penapisan . .

10. Koleksi Genom Parsial B. aquimaris Pemotongan dengan EcoR I genom B. aquimaris/EcoR I λ/Hind III sisipan 23.130 pb 9.416 pb 6.557 pb 4.361 pb plasmid 2.322 pb 2.027 pb • Diperoleh 5000 koloni transforman • Masalah: penapisan  false positive

11. Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) • http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

12. ±800 bp ±800 bp Analisis in silico

13. Degenerate PCR

14. reverse forward Komponen PCR • Templat • DNA polimerase • Bufer DNA polimerase • dNTP • Primer forward (degenerate) • Primer reverse (degenerate)

15. Degenerate Primer • >< specific primer • Campuran primer yang mirip • Dirancang dari urutan asam amino yang telah diketahui atau hasil penjajaran gen yang sama dari beberapa organisme lain yang telah diketahui

16. Empat Daerah Lestari Keluarga -Amilase B A C

17. B. coahulensis Bacillus sp. SG-1 B. weihestephanensis B. coahuilensis

18. B. weihestephanensis B. coahuilensis B. coahuilensis Bacillus sp. SG-1 B. licheniformis B. subtilis

19. Daerah Lestari berbagai Bacillus

21. Rancangan Primer

23. Perancangan Degenerate Primer • Panjang: ~20 (18-24) • Ujung 3’: G/C • 3 basa di ujung 5’ dan 3’ tidak boleh komplemen • %GC: 40-60, Tm: ~60oC • Ujung 3’: hindari degenerate, dipillih basa yang pasti

24. Pengaruh jumlah primer Variasi jumlah primer Primer yang diperlukan pada degenerate PCR jauh lebih banyak daripada PCR biasa (5-10X) Normal: 20 pmol/50 μL reaksi Degenerate: 100-200 pmol/50 μL reaksi • 4 3 2 1 • x normal

25. 523-544 307-329 820-842 943-964 For 1 For 2 Rev 3 Rev 2 928-949 Rev 1 Rev 4 Isolasi gen α-amilase: degenerate PCR 643 658 536 238 1 1437 643 pb 307 949 320 442 427 Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1

26. Inverse PCR

27. reverse forward 643 pb Komponen PCR • Templat • DNA polimerase • Bufer DNA polimerase • dNTP • Primer forward (spesifik) • Primer reverse (spesifik)

28. Inverse PCR Enzim restriksi kromosom Self-ligasi PCR Hasil PCR

29. 11-30 117-136 165-184 388-407 1 523 427 949 155-160 Cla I Harus ada daerah yang telah diketahui urutannya dengan pasti: menentukan enzim restriksi, merancang primer spesifik

30. ClaI ClaI ClaI InvF InvR InvF ClaI InvR InvR ClaI ClaI ClaI InvF Pemotongan dengan enzim restriksi Self-ligasi PCR

31. 949 307 ClaI 949 112 HindIII 112 1437 HindIII 1437 -102 1 1539 Isolasi gen α-amilase: inverse PCR 643 pb 838 pb 1326 pb 1539 pb Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1

32. Urutan Gen -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAGGTGCAGTTGAAAAAGAAGAACGAAAG M K R R V L S L I L V P F L L F Y A L P V G AV E K E E R K TGGCAGGATGAAACAATTTATTTCCTAATGGTAGATCGCTTTAACAATGGTGATCCAACAAATGATAAAGAAGTGAACACAAAGGATCCC W Q D E T I Y F L M V D R F N N G D P T N D K E V N T K D P AAGGCTTACCATGGCGGTGATTTCCAAGGGGTTATCGATCGATTGGATTACATCAAAGATATGGGATTCACTTCCATATGGCTGACTCCC K A Y H G G D F Q G V I D R L D Y I K D M G F T S I W L T P GTATTTGACAACCAGCCAAAAGGATACCATGGATATTGGATTACGGACTTTTATAAGACCGACGAGCATTTCGGTACGATGGAAACGTTC V F D N Q P K G Y H G Y W I T D F Y K T D E H F G T M E T F AAAAAGCTTGTAGAAGAAGCACATAAGCGGGATATGAAAGTCGTCCTTGATTTTGTGGTTAACCATGTGGGGCCGGAGCATCCCTGGGTG K K L V E E A H K R D M K V V L D F V V N H V G P E H P W V GATGACCCTGCAAAAGAAGACTGGTTCCACGAAAAACAGCCAATGAACTTCTCCGACAAAGAAAGTCTTCAGAACGCATGGCTGTATGAC D D P A K E D W F H E K Q P M N F S D K E S L Q N A W L Y D CTTCCTGATTTAAACACAGAGAATCCCGAAGTAAGGGAATATCTCTTTGATGCTGCCAAATGGTGGATCAAAGAAACGGATGTCGACGGT L P D L N T E N P E V R E Y L F D A A K W W I K E T D V D G TATCGTCTGGACACGGTGCGCCATGTTCCACAAGATTTTTGGAGTGATTTCAGTAAAGAAGTTAAATCAGTGAAAGACGATTTTTATCTT Y R L D T V R H V P Q D F W S D F S K E V K S V K D D F Y L CTTGGTGAAGTGTTTGATCGTGACCCACAGAAGATAGCAGAATATAACGATGTGGGTATCGATGGATTCGTTAATTTCCCCCAAGCTGAA L G E V F D R D P Q K I A E Y N D V G I D G F V N F P Q A E GAATTACGTTCAGTGTTTAACAAACCTGATACTTCAATGGACAGGTTGTTCAATTTCTGGAAGTACAATGAAACATTTTATGAAGATCCT E L R S V F N K P D T S M D R L F N F W K Y N E T F Y E D P TATTTGATGGGGACTTTTATAGACAACCATGATATGGAACGTTTTACACGTTTATTGGTACAGGAAAATGTTTTCCCTGGTACCCGTTGG Y L M G T F I D N H D M E R F T R L L V Q E N V F P G T R W AAACTCGCCTTGACATATATGTACACGACTCCGGGAATACCGATTGTGTATTATGGGTCTGAAATTGCCATGGATGGCGGGGAAGACCCG K L A L T Y M Y T T P G I P I V Y Y G S E I A M D G G E D P GATAACCGGCGGTTGATGAATTTCAGGGCCGACAAAGAACTGATTGATTACATTTCAAAACTGGGCAAGGTTCGAAAGGACTATCCTGCT D N R R L M N F R A D K E L I D Y I S K L G K V R K D Y P A TTGACAAGAGGAACGATAGAGCCGTTGTATGAACAAGACGGATTGGGAATATATAAACGCGCATACAAAGATCAAACGGTGGTTGTAGCC L T R G T I E P L Y E Q D G L G I Y K R A Y K D Q T V V V A ATCAATAATTCCAGTGAGACCCAAACTGTCGAACTTGATGAAGGGGAGCTTGCTGATAACAATGAACTAAAAGGGTTACTTTCAGATGAC I N N S S E T Q T V E L D E G E L A D N N E L K G L L S D D CTGGTGAGAAGCGATGAAAACGGGACGTATAAAGTCGCTTTGGATCGTGAAGAAGCAGAGATTTATCTGCTTAAAGCCAAAAGTGGACTG L V R S D E N G T Y K V A L D R E E A E I Y L L K A K S G L AACATCCCATATTTATCAGCACTTGCTGCGGTGTATGTATTATTTTTATTATTTATTTATCTAGTATGGAAACGCGGAAGAAAAAACCGC N I P Y L S A L A A V Y V L F L L F I Y L V W K R G R K N R AAATCATAA 1539 bp K S . 512 aa