Novecošanās un ģenētika

1. Novecošanās un ģenētika LU 66. konference Autori: Andis Brakmanis; Astrīda Krūmiņa; Liāna Pliss; Inese Pelnēna;Viesturs Baumanis

2. Pētījums veikts LU zinātniskā projekta nr.: 2007/ZP-5 ietvaros

3. Novecošanās • Bioloģisks process, kas raksturojas ar progresējošu un neatgriezenisku fizioloģisko funkciju zudumu, kā arī mirstības palielināšanos līdz ar vecumu (Schal a. Weindruch, 1996); • Izpratne par novecošanās molekulārajiem mehānismiem ir svarīga, lai mēģinātu izveidot terapiju, kas pagarinātu cilvēku mūžu un samazinātu mirstību vecāku cilvēku populācijā.

4. Novecošanās veidi • “Normāla” – to raksturo virkne vecu cilvēku slimību (ateroskleroze, osteoporoze un neirodeģeneratīvas slimības); • “Sekmīga” jeb “veselīga” – nozīmē, ka cilvēks spēj izvairīties no iepriekš minētajām slimībām; • “Patoloģiskā” – ar vecumu saistītās slimības sākas agrīnāk un ir samazināts dzīves ilgums (Rowe and Kahn; Science 1987).

5. Novecošanās molekulārās teorijas • Mitohondriālā teorija • Telomēru teorija • Izmaiņas gēnu ekspresijā • DNS bojājumu uzkrāšanās

6. Mitohondriji Galvenās mitohondriju funkcijas: • ATP sintēze; • Lipīdu, ogļhidrātu un proteīnu oksidācija līdz CO2 un H2O; • Intracelulāro jonu homeostāzes uzturēšana (Ca++,H+u.c.); • Apoptozes regulācija; • Daļēji autonoma mitohondriālo proteīnu sintēze.

7. Mitohondriālā teorija • Pirmo reizi apspriesta 1950. gadā, kā brīvo radikāļu teorija. • Dzīves laikā progresīva somatisko mutāciju uzkrāšanās mtDNS noved pie neatgriezeniskas mitohondriju funkciju izsīkšanas postmitotiskajos audos (Harman, 1992). • Izmaiņas mitohondriju funkcijā un morfoloģijā novecojot (Loeb et al., 2005).

8. Mitohondriju bojājums mtDNS punktveida mutācijas Mutantās mtDNS amplifikācija mtPTP aktivācija Šūnas nāve Šūnu daudzums funkcionālais slieksnis Bērnība Jaunība Pusmūžs Vecums “Mitohondriālais novecošanās pulkstenis”

9. mtDNS • Katrā šūnā ir apmēram 1000 -10 000, bet mitohondrijā 1 – 15 mtDNS kopijas; • Cirkulāra, divpavedienu DNS; • Sastāv no 16 569 bp; • Nav pierādīta rekombinācijas; • Ir nedaudz atšķirīgs ģenētiskais kods nekā kodola DNS; • Ir 37 gēni, kas kodē 13 proteīnus, 22 tRNS un 2 rRNS; • Nav intronu.

10. mtDNS mutācijas • Adaptīvās mutācijas bieži notiek mtDNS kodona trešajā nukleotīdā (AGA), neizraisot aminoskābju nomaiņu; • Adaptīvās mutācijas ir populāciju specifiskas un nostabilizējas mtDNS evolūcijas laikā, populācijai pielāgojoties apkārtējas vides apstākļiem. • Iedzimtais mtDNS genotips: • Haplotips – konkrēts mtDNS sekvences tips, kas var būt unikāls vai arī atrasts vairākos indivīdos; • Haplogrupa – līdzīgu haplotipu kopums, kuriem ir viena vai vairākas kopīgas alēles.

11. Mērķis • Noskaidrot mtDNS polimorfismu iespējamo saistību ar novecošanos Latvijas populācijā; • Noteikt heteroplazmijas biežumu dažādās vecuma grupās.

12. Materiāls • mtDNS polimorfismu analīzei izmantoti latviešu DNS paraugi: • 351 paraugs vecumā no 18 līdz 40 gadiem (1.grupa); • 98 paraugi vecumā no 74 līdz 89 gadiem (2.grupa); • 74 paraugi vecumā virs 90 gadiem (3.grupa). • Heteroplazmijas analīzē iekļauti 100 paraugi: • 40 paraugi vecumā no 18 - 40 gadiem; • 30 paraugi vecumā no 74 - 89 gadiem; • 30 paraugi virs 90 gadiem.

13. Metodes • Iedzimto haplotipu un haplogrupu noteikšana: • HVSI (620bp) un HVSII (450bp) segmentu tiešā nukleotīdu sekvenēšana; • mtDNS kodējošā rajona PCR-RFLP analīze; • Datu statistiskā apstrāde ar ARLEQUIN 3.0 programmu (Excoffier, 2005). • Heteroplazmijas noteikšana: • “mismatch” specifiskā DNS endonukleāze; • Denaturējošā gradienta gēla elektroforēze; • HVSI (620bp) segmenta tiešā nukleotīdu sekvenēšana; • Datu statistiskā apstrāde ARLEQUIN 3.0 programmu (Excoffier, 2005).

14. RezultātimtDNS ģenētiskā daudzveidība A. Haplogrupas un HVSI

15. RezultātimtDNS ģenētiskā daudzveidība B. Haplogrupas, HVSI un HVS II

16. RezultātiHaplogrupu izplatība

17. Latvieši; Somi Latvieši Franči; Īri Japāņi Rezultāti

18. RezultātimtDNS heteroplazmija HVSI segmentā

19. Telomēri • Telomēri ir fizikālie lineāro hromosomu nobeigumi eikariotu hromosomās; • Vairumā izpētīto organismu telomēri satur garus posmus ar tandēmi atkārtotām, vienkāršām DNS sekvencēm [(TTAGGG)n], kas veidotas no G – un C- bagātiem posmiem (tā saucamie terminālie atkārtojumi).

21. Telomēru teorija • “Replikācijas beigu problēma” – notiekot replikācijai saīsinās telomēri un sasniedzot noteiktu kritisko garumu apstājas šūnas cikls (Alsopp et al., 1992); • “Uncapping” – telomēru struktūras bojājums, kas izraisa genoma nestabilitāti (Shay et al., 2004);

22. Secinājumi Mūsu rezultāti apstiprina hipotēzi, ka noteikti iedzimtie mtDNS polimorfismi ir saistīti ar novecošanos. Heteroplazmijas līmenis pakāpeniski palielinās līdz ar vecumu, kā arī vecākiem indivīdiem ir vairāk heteroplazmiskās pozīcijas. Lai saprastu novecošanās molekulāri ģenētisko mehānismu, nepieciešams veikt cilvēka genoma stabilitātes pētījumus (telomēru “cap” struktūra).