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Aminoácidos, peptídeos e proteínas. Prof. Dr. Francisco Prosdocimi. Características químicas dos aminoácidos. Prof. Dr. Francisco Prosdocimi. Os aminoácidos. Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L A biologia é canhota Glicina não tem isomeria óptica. Carbono alfa.

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amino cidos pept deos e prote nas

Aminoácidos, peptídeos e proteínas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

caracter sticas qu micas dos amino cidos

Características químicas dos aminoácidos

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

os amino cidos
Os aminoácidos
  • Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L
    • A biologia é canhota
  • Glicina nãotem isomeriaóptica

Carbono alfa

grupo r apolar e alif ticos
Grupo R apolar e alifáticos
  • Aminoácidos apolares e hidrofóbicos
  • Ligações de Van der Waals
  • Ala, Val, Leu, Iso
    • Interações hidrofóbicas
  • Gly; menor aminoácido
  • Met
    • Possui átomo de enxofre
  • Pro
    • Iminoácido, menor flexibilidade estrutural
grupo r arom ticos
Grupo R aromáticos
  • Aminoácidos hidrofóbicos
  • Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água
  • Modificações pós-traducionais
    • Fosforilação do OHda tirosina
  • Fenilalanina
    • Mais apolar
grupos r polares n o carregados
Grupos R polares, não carregados
  • Solubilidade intermediária em água
  • Serina e treonina
    • Grupos hidroxil
  • Asparagina e glutamina
    • Grupo amida
  • Cisteína
    • Grupo sulfidril
    • Ligações dissulfeto
grupos r carregados
Grupos R carregados
  • Aminoácidos básicos
    • Carga positiva
    • Lisina, segundo grupo amino
    • Arginina, grupo guanidina
    • Histidina, grupo aromático imidazol
  • Aminoácidos ácidos
    • Carga negativa
    • Possuem segundo grupoácido carboxílico
amino cidos incomuns
Aminoácidos incomuns
  • Modificações pós-traducionais
    • 4-hidroxiprolina
    • 5-hidroxilisina
    • 6-N-metil-lisina
    • Gama-carboxiglutamato
    • Fosforilação de resíduos
  • Selenocisteína
    • Selênio ao invés de enxofre na Cys
    • É adicionado durante a tradução pormecanismo específico e regulado
ph e pka
pH e pKa
  • Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas
  • Ionização
  • < pH; > [H]+estado não-ionizado
amino cidos s o ioniz veis
Aminoácidos são ionizáveis
  • Substâncias anfóteras: possuem natureza dual
  • Podem funcionar assim como ácidos ou bases
    • Doam ou recebem prótons
titula o de um amino cidos
Titulação de um aminoácidos
  • pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio
  • Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio
  • Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas
curvas de titula o predizem a carga el trica dos amino cidos
Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos
  • Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral
pept deos e prote nas

Peptídeos e proteínas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

polipept deo
Polipeptídeo

>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

pept deos tbm s o ioniz veis
Peptídeos tbm são ionizáveis
  • Ou seja, possuem curva de titulação característica
  • Funcionam em faixas de pH ótimas
uso de amino cidos
Uso de aminoácidos
  • Varia bastante entre as proteínas
  • Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula
prote nas com outros grupos qu micos
Proteínas com outros grupos químicos
  • Adicionados pós-traducionalmente
trabalhando com prote nas

Trabalhando com proteínas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

prote nas podem ser separadas e purificadas
Proteínas podem ser separadas e purificadas
  • Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas?
    • Basta selecionar por propriedade
      • Tamanho, carga e propriedades de ligação
  • Obter o extrato bruto
    • “correr” em cromatografia de coluna
      • Fase estável (matriz)
      • Fase móvel (solução com tampão)
    • Coluna maior permite maior resolução na separação
cromatografia por troca i nica
Cromatografia por troca iônica
  • Polímero carregado negativamente
    • Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna
  • Afinidade da proteína é definido também pelo pH
cromatografia por exclus o de tamanho
Cromatografia por exclusão de tamanho
  • Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores
  • Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro
cromatografia de afinidade
Cromatografia de afinidade
  • Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse
  • Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz
  • Elui-se com solução de ATP
eletroforese hist rico
Eletroforese -- Histórico
  • 1952, Markham and Smith
    • Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
  • 1955, Smithies
    • Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano
  • 1967, Loening
    • Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA
  • 1980, Schwartz and Cantor
    • Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes
  • É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...

Vou ali correr um gelzinho e já volto

Tenho que ir senão vou perder meu gel

eletroforese
Eletroforese
  • Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme
  • DNA, carga negativa
    • Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico
  • Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica
    • Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS)
  • Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
eletroforese etapas
Eletroforese, etapas
  • Preparação do gel
  • Aplicação das amostras
  • Eletroforese
  • Coloração
  • Análise dos resultados
prepara o do gel
Preparação do gel

Horizontal X Vertical

Agarose X Poliacrilamida

aplica o das amostras
Aplicação das amostras

Definição do mapa das amostras por canaleta

corrida do gel
Corrida do gel
  • Aplicação do campo elétrico
  • Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão
  • Terminais positivo e negativo
  • Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
colora o das mol culas
Coloração das moléculas
  • Prata
    • Gel SDS-PAGE
      • PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
    • Melhor resolução
  • Coomassie blue, etc
  • Brometo de etídio
    • Agente intercalante do DNA
      • Cancerígeno!
    • Composto fluorescente à luz UV
    • Gel de agarose
o marcador de peso molecular
O marcador de peso molecular
  • Comprado de uma empresa
    • Possui proteínas de peso molecular bem conhecido
  • Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra
geis bidimensionais
Geis bidimensionais
  • Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão
  • Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra
    • Maiores géis dão maiores resolução
prote nas n o separadas podem ser quantificadas
Proteínas não separadas podem ser quantificadas
  • Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa
  • Deve-se poder medir o produto da ação enzimática
  • Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC
estrutura prim ria das prote nas

Estrutura primária das proteínas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

as estruturas prim rias das prote nas s o conhecidas
As estruturas primárias das proteínas são conhecidas
  • Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo
  • As pontes dissulfetopodem se formar entre diferentes cadeias protéicas
    • E principalmente dentro da mesma
sequenciamento de pept deos
Sequenciamento de peptídeos
  • Degradação de Edman
    • Marca e remove apenas o resíduo N-terminal
  • Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas
  • Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina
produ o de pept deos
Produção de peptídeos
  • Purificação a partir de tecidos
  • Engenharia genética
  • Síntese química direta
alinhamento de sequ ncias
Alinhamento de sequências
  • Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas)
    • Derivam do ancestral comum entre os organismos
  • O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína
evolu o molecular
Evolução molecular
  • Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente
conclus es
Conclusões
  • Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas
  • Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenasou milhares para formar peptídeos e proteínas
  • As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente
  • As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese
  • As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida)
  • As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra