2012 seminar in life science n.
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101-1 書報討論

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2012 Seminar in Life Science. 101-1 書報討論. 目的. 表達能力 臨場應變 組織整理 能力 資料收集 能力 專業 英文能力. 上課規定. 文獻選擇標準: 三 年內生命科學相關 SCI 期刊 避免臨床、公衛以及非研究報告(如 letter to editor, short communication 等) 選擇高 點數 期刊( >5 ) 或是長篇幅的文章 ( 超過 8-9 頁)要有相當準備 可以的話請你的專題研究或是實習的老師幫忙鑑定一下適不適合你. 上課規定. 當次演講同學請提前到場準備 發放 大綱

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Presentation Transcript
slide2
目的

表達能力

臨場應變

組織整理能力

資料收集能力

專業英文能力

slide3
上課規定
  • 文獻選擇標準:
    • 三年內生命科學相關 SCI 期刊
    • 避免臨床、公衛以及非研究報告(如 letter to editor, short communication 等)
    • 選擇高點數期刊(>5)或是長篇幅的文章(超過8-9頁)要有相當準備
  • 可以的話請你的專題研究或是實習的老師幫忙鑑定一下適不適合你
slide4
上課規定
  • 當次演講同學請提前到場準備
    • 發放大綱
    • 上傳檔案(檢查檔案)
    • 借器材(簡報遙控器)
  • 下次上課演講同學請一併到場幫忙準備,同時幫忙計時
  • 準時開始演講是重要的禮貌
slide5
上課規定

每次上課三位同學報告,每位報告時間20-25 分鐘,報告時間不足15分鐘或超過30 分鐘者需重講

準時結束演講也是重要的禮貌

slide6
上課規定
  • 定期點名
    • 沒到一次扣總成績5分
    • 要更換報告順序請先通知,演講者無故缺席一律當掉(這是演講的大忌)
    • 請假請附上假單
slide7
上課規定
  • 成績
    • 成績為 演講時間控制、投影片內容、演講內容與技巧與回答問題表現四項綜合
    • 認真問問題的同學加分(總成績 0.5)
    • 演講者須於報告的隔週繳交問題的書面回覆(連同投影片email 給我),未交及遲交者總成績扣 20 分
slide8
上課規定

飲食請低調(以不干擾他人為原則)

討論請低聲

禁止攜帶任何電子用品

手機請關機或是調整為靜音

以上是聽演講一般的禮貌

slide9
上課規定
  • 報告當天請提供一張A4 的大綱(可雙面)給每個聽眾
    • 大綱內容最少應包含:
      • 中英文題目、期刊及日期
      • 報告人姓名、學號及報告日期
      • 中英文摘要
      • 本篇文章的結論整理(中英文)
  • 請給老師一份原始文獻的紙本
slide10
演講技巧

熟讀文章內容,把每個你不知道不瞭解的部分查清楚弄懂(因為你永遠不知道聽眾會問哪些問題)

事先在家裡練習,把講不順的地方改進,必要時把通順的說法背起來(同時也可以順便調整演講的時間)

slide11
演講技巧

用心組織與微調投影片編排,好的投影片可以幫助你順暢的表達

投影片是輔助你演講的工具,所以投影片上的內容應該是「提示」與「大綱」,而不是演講內容的全部

slide12
演講技巧

確實的介紹與文獻內容相關的背景資料,有助於引導聽眾進入狀況

在敘述重要的發現與結論時使用中性的科學或描述,幽默雖然有助於維持聽眾的注意力,但是切記流於搞笑

slide13
演講技巧

掌握每一個從你口中說出的字詞,避免造成混淆誤會

充分瞭解文獻的內容可以幫你帶來自信

slide14
演講技巧

當文獻篇幅不大時,可以多講一些背景資料,篇幅太長時可以將背景與材料方法簡述(但不是砍掉不講)

不要拘泥於你選的文獻,好的演講往往會加入一些補充資料使得演講更順暢(請注意資料的可靠度)

slide15
演講技巧

適當的使用動畫可以幫助聽眾瞭解(但是不要流於浮濫)

在講解圖表時可以加入色彩或是輔助符號(如箭頭)也可以幫助聽眾瞭解

slide16
演講技巧

將實驗內容整理成流程圖對聽眾的理解會很有幫助

在準備投影片時,可以站在客觀的立場想想看這篇文獻的邏輯和說服力

slide17
回答問題技巧

確實的瞭解聽眾的問題,必要時可以請發問的人再解釋一下問題的重點

虛心接受聽眾的意見,理性的討論聽眾的問題

slide18
回答問題技巧

使用中性客觀的方式回答問題,最好能展現自信

遇到不清楚的部分請直接回答「不清楚,會再去找答案,並且在書面回覆中答覆」

slide19
回答問題技巧

回答問題先想清楚再說出口

slide20
絕對不能犯的錯誤

把文章內容剪下貼上,然後邊看投影片邊翻譯或解釋(請整理成大綱並且把內容背起來)

用含糊的說法把不懂的部分混過去(是的,老師沒有這麼好混過去)

slide21
絕對不能犯的錯誤

回答問題時不懂卻硬拗,甚至與發問的人爭吵

自己也不知道這篇文獻在講啥,不知道這篇研究的動機目的

使用翻譯軟體

slide22
絕對不能犯的錯誤

投影片內容或是回答問題時只顧著搞笑

演講時間嚴重失控

講到一半卡在台上,不知道要怎麼接下去(所以複雜的演講內容要背起來)

slide23
絕對不能犯的錯誤

把文章內容,尤其是討論的部分偷工減料自行刪減

把作者的意見斷章取義

投影片順序亂七八糟,演講時投影片跳來跳去

slide24
絕對不能犯的錯誤

一邊講一邊翻 paper(或者是你自己整理的重點)

slide25
常犯的小錯誤

錯字會造成不必要的誤解,而且會降低聽眾對演講者的印象

慣性的口語文字,例如「然後」

結巴以及口腦不協調(練習和背記演講內容)

slide26
常犯的小錯誤

聲音太小聲

一邊講一邊笑

錯誤的發音

答非所問

slide27
重講

重講只有一次機會

請針對第一次報告的缺陷進行改善

沒有重講或是重講不及格者當掉

slide29
Protein Expression and Purification, 2011, In Press

Fulya Ay, HakanKaraoglu, KadriyeInan, SabriyeCanakci and Ali Osman Belduz

Cloning, purification and characterization of a thermostablecarboxylesterasefrom Anoxybacillus sp. PDF1

anoxybacillus sp pdf1
Anoxybacillus sp. PDF1

SeferihisarKarakocHotspring in Turkey

lipases
Lipases

(http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/

NOTES/ENZYMES/enzyme_mechanism.html)

(Protein Data Bank)

Lipases (triacylglycerol acylhydrolases; EC 3.1.1.3)

lipases1
Lipases

(http://www.bio.anl.gov/molecular_and_systems_biology/Enzymatic_Screening/enzyme4.html)

Esterases (carboxylic–ester hydrolases; EC 3.1.1.1)

(http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/Pestweb/pest2.html)

lipases2
Lipases

(http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/

NOTES/ENZYMES/enzyme_mechanism.html)

Consensus a.a. sequence: Gly-X-Ser-X-Gly

Ser-Asp-His : “catalytic triad”

Hydrolysis and synthesis of esters

Hydrolysis and transesterification of triacylglycerols

Resolution of racemic mixtures

carboxylesterase
Carboxylesterase

Food industry, biological detergent, medical applications and enzymatic production of lipophillic chemicals

Extreme stability at elevated temperatures and in organic solvents

High regio- and stereo-specificity, no cofactor required, stable even active in organic solvents

slide36
Aim

Cloning and characterization of a thermostablecarboxylesterase from Anoxybacillus sp. PDF1

framework
Framework

Isolation and idetification of Anoxybacillus sp. PDF1

Carboxylesterase cloning

Overexpression of PDF1Est in E. coli

Purification of PDF1Est by heat-shock and ion-exchange

Kinetic parameters

Metal ion and other reagents

pH

Temperature

cloning
Cloning

NcoI

  • PDF1Est was directly cloned by PCR according the sequence of A. flavithermus lipase
  • PCR primers:
    • EstF1:5’-CCCATGGTGTAAGATGATTCC-3’
    • EstR1:5’-CGGAATTCCTATCTACCAATCTAATGATTC-3’

EcoRI

cloning1
Cloning

A

A

pGEM-T vector system

cloning2
Cloning

pGEM-T vector system

cloning3
Cloning
  • PDF1Est was directly cloned by PCR according the sequence of A. flavithermus lipase
  • PCR primers:
    • EstF1:5’-CCCATGGTGTAAGATGATTCC-3’
    • EstR1:5’-CGGAATTCCTATCTACCAATCTAATGATTC-3’
cloning4
Cloning

PDF1Est was a 714 bp ORF encoding a hypothetical 246 a.a. protein (26 kDa)

PDF1Est was identified as carboxylesterase by Blast search

e xpression
Expression

pLysS

  • pET28a(+)
    • T7 promoter
    • E. coli BL21(DE3):pLysS
expression of pdf1est
Expression of PDF1Est

2 L LB with 50 mg/mLkanamycin

1 mM IPTG induction at OD600 = 0.6

11,000 rpm for 5 min. after 4 h, 37 ℃ induction

Sonication in 50 mMTris-HCl (pH 8.0) buffer

80 % power, 0.6 cycles/5 min.

14,800 rpm for 15 min. to collect cell-free supernatant

purification of pdf1est
Purification of PDF1Est

55 oC, 15 min, 14,800 rpm 15min,

discard precipitate

Q-Sepharose Fast Flow (50 ×1.5 cm)

Gradient elution 0-0.6 M NaCl with

1 mL/min flow rate

Dialysis overnight against

20 mMTris-HCl (pH 8.0)

14,800 rpm for 15 min. to collect cell-free supernatant

Protein conc. (Bradford) and enzyme activity assay

purification of pdf1est1
Purification of PDF1Est

Ion-exchange purified

Heat-treated

Crude

PDF1Est, ~26 kDa

enzyme activity test
Enzyme activity test

p-NPB(10 mM in MeCN): EtOH:50 mMTris-HCl (pH 8.0) = 1:4:95

0.3 mL enzyme solution + 0.9 mL substrate solution incubated for 20 min.

p-nitrophneyl butyrate

OD405 (yellow)

Unit definition:

1 U of enzyme = amount of enzyme liberating 1 mmol of p-NP/min at 60oC

effect of temperature
Effect of Temperature

40-90oC preincubation for 30 min.

Residual activity at 60oC

effect of ph
Effect of pH

Preincubation for 30 min. at pH 5-10

Residual activity at pH 8

kinetic parameters
Kinetic parameters

Km = 0.348 mM

Vmax = 3725.8 U/mg

Kcat = 1500 ±54.50/s

discussion
Discussion
  • The identity of PDF1Est to lipases/esterases:
    • 91% to A. flavithermus WK1
    • 80% to GeobacillusstearothermophilusEst30
    • 79% to G. kaustophilusHTA426
    • 79% to G. thermolevoransEstA
    • 79% to G. thermodenitrificansNG80 Est30
discussion1
Discussion
  • The classification of PDF1Est (Arpigny and Jaeger, 1999):
  • Some similarity to the family VI:
    • 23-26 kDa
    • Active to short-chain triacylglycerides
    • Catalytic triad: Ser93, Asp192 and His 222
phylogenic analysis
Phylogenic analysis

new

VI

IV

MEGA 4.1 software (neighbor joining method)

discussion2
Discussion

Belongs to new carboxylesterase family

Heat-treatment and Q-Sepharose purification yield high activity and pure carbpxyesterase

discussion3
Discussion

Short chain fatty acid substrate is preferred (to long chain)

Good thermo-stability among carboxylesterases

discussion4
Discussion

PDF1Est follow simple Michelis-Menten kinetics

Km value is in the range of industrial esterase (0.1-0.00001 M)

discussion5
Discussion

Inhibit by Co2+ and Zn2+

Ca2+ independent

Not a metalloprotein (not inhibited by EDTA)

Serine esterase (inhibited by PMSF)

conclusion
Conclusion

The stability of the enzyme in broad pH and high temperature suggests its usefulness in industrial applications