MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS E DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA

1. Universidade Federal do Ceará Rede Nordeste de Biotecnologia Analise Proteômica MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS E DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Erika B. de Menezes Prof. Arlindo de Alencar A. Moura

2. MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA

3. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Propriedades desejáveis • Faixa dinâmica de detecção; • Sensibilidade; • Linearidade; • Reprodutibilidade; • Compatível com espectro de massa; • Baixa toxicidade; • Baixo custo. (Lópes, 2007)

4. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • 1 µg de Proteína Revelação por Coomassie Revelação pela Prata (Lópes, 2007)

5. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Revelação por Azul Brilhante de Coomassie - CoomassieBlue • Revelação fluorescente (Sondas Moleculares) • SyproRuby • Eletroforese em gel diferencial – DIGE • Revelação pela Prata

6. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE (COOMASSIE BLUE)

7. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • Azul Brilhante de Coomassie • Composto aromático de caráter ácido • Tingir lã • “Tintura de Coomassie” • 1963 • Revelação de proteínas (Fazekas de St. Groth et al., 1963)

8. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • CBB-R 250 • Aromático sulfatado, não polar • Ácido acético e metanol • Interações iônicas • Interações secundárias • Pontes de hidrogênio • Interação de Van der Waals • Interações hidrofóbicas (amônia sulfatada) (Fazekas de St. Groth et al., 1963)

9. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • Ácido tricloroacético (TCA a 12,5%) • Alta acidez e propriedade corrosiva • Coomassie Blue (CBB-R 250) •  sensibilidade (Fazekas de St. Groth et al., 1963) (Merril, 1990)

10. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • CBB-G 250 (Coomassie Blue colloidal) • Dimetilado  CCB-R • 20% de metanol •  [sulfato de amônio] • Pnt/CCB-G • Não penetra na matriz apenas interage com a pnts. (Neuhoff et al., 1988) (Fazekas de St. Groth et al., 1963)

11. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE •  sensibilidade • 10 ng ptn/banda • Formação do colóide • Prolongou o tempo de coloração • Metanol  etanol • Tempo recomendado foi de pelo menos 24h (Brush, 1998) (Neuhoff et al. 1985)

12. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • Sulfato de alumínio (Al2(SO4)3) •  a ligação do corante as proteínas •  Sensibilidade (Kang et al. 2002) A – Coomassie Blue B- Coomassie Coloidal *Sulfato de amônio + etanol C- Prata (Kang et al. 2002)

13. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • Coloração Azul • Sulfona do Coomassie • Amina das proteínas • Especificidade • Proteínas • Não requer separação prévia das Pnt e Aa. (Reisner et al., 1975) (Fazekas de St. Groth et al., 1963) (Chrambach et al., 1963)

14. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • Vantagens • Intensa capacidade de coloração; • Elevada solubilidade em géis de poliacrilamida e agarose; • Capacidade de distinção entre pnt e Aa.; • Compatível com Espectro de Massa; • Estável na forma sólida; • Fácil manuseio; • Baixo custo. (Fazekas de St. Groth et al., 1963)

15. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • Limitações • Fraca revelação das bandas; • Pouco contraste com o gel levemente corado de azul; •  Sensibilidade; • 50 a 100 x menos sensível que a prata; •  Faixa dinâmica de detecção.

16. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • CoomassieBlue G-250

17. REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE • Coomassie Blue G-250

18. REVELAÇÃO FLUORESCENTE

19. REVELAÇÃO FLUORESCENTES • Revelações Sypro – Sondas moleculres • Sypro Orange; • Sypro Red; • Sypro Tangerine; • Sypro Ruby. 1D SDS PAGE 2D SDS PAGE (Pathon et al., 2002)

20. REVELAÇÃO FLUORESCENTES • Sypro Ruby • Coloração baseado em um quelato; Cultura de Fibroblastos (Berggren et al., 2000) (Pathon et al., 2002)

21. REVELAÇÃO FLUORESCENTES • Sypro Ruby • Protocolo simples; • Glicoproteínas, lipoproteínas; • Compatível com EM; • Marcador durante a FIE • ½ vida longa – não foi alcançado aos 19’ • Mais resistente a foto clareador (Steinberg et al., 1996) (Berggren et al., 2000) (Steinberg et al., 2000) (Berggren et al., 1999) (Smejkal et al., 2004)

22. REVELAÇÃO FLUORESCENTES • Sypro Ruby • Transiluminador UV • 300 nm • Scanner a laser • Typhoon

23. REVELAÇÃO REVELAÇÃO POR CORANTE FLUORESCENTES • Vantagens • Compatível com Espectro de massa (MALDI-TOF MS); • Identifica pequenas quantidade de ptn. ; •  Limite dinâmico linear •  variabilidade entre géis; • quando comparada com a prata • Permite visualizar + 20% de spots • Melhor reprodutibilidade; • Reutilização para vários géis. (Lopez, 2000) (Patton, 2000) (Patton, 2002)

24. REVELAÇÃO REVELAÇÃO POR CORANTE FLUORESCENTES • Limitações • Elevado custo; • Uso de equipamento sofisticado • Scanner (Typhoon)

25. REVELAÇÃO FLUORESCENTES • Eletroforese em gel diferencial – DIGE • Disponível em 1997 (Unlu et al., 1997)

26. REVELAÇÃO FLUORESCENTE

27. REVELAÇÃO FLUORESCENTE Cy3 controle Cy5 Tratamento 27 (Unlu et al., (1997) (Issaq & Veenstra (2008)

28. REVELAÇÃO FLUORESCENTE • Vantagem • Menor tempo de analise; • Elimina o problema de reprodutibilidade; • Melhor comparação do perfil protéico entre indivíduos; • Maior acurácia nas comparações de proteínas de diferentes amostras (95% de confiança) • Alta sensibilidade.

29. REVELAÇÃO FLUORESCENTE • Limitações • Dificuldade de cortar spots para analise posterior; • Spots são visíveis por scanner específicos; • Elevado custo.

30. REVELAÇÃO PELA PRATA

31. REVELAÇÃO PELA PRATA • Laboratórios de histologia • Géis de Poliacrilamida – Switzer et al., 1976 • Proteínas • Protocolos utilizados em 2D • Nitrato de Prata • Diamino de prata ou prata amoniacal [Ag(NH3)2] (Merryl et al., 1976) (Haines et al., 1990)

32. REVELAÇÃO PELA PRATA • Depende da redução do íon prata  prata metálica (Ag0) • (Ag  + elevado potencial de oxidação) • Íons Ag interagem com grupos • ácidos carboxílicos ( Asp e Glu), sulfidrilicos (Cys), e aminas (Lys). • Formando a prata metálica • 2 Ag(NH3)2++ 2 HS-R  2 Ag0 + 4 NH3 + R-S-S-R + 2 H+ (Haines et al., 1990)

33. REVELAÇÃO PELA PRATA • Etapas • 1º fixação – insolubilização das proteínas no gel e remover componentes de interferência (Glicina, TRIS, SDS); • 2º Sensibilização • 3º Impregnação pela prata; • 4º Revelação • Nitrato de Prata – Formaldeído, Carbonato e tiosulfato (Haines et al., 1990)

34. REVELAÇÃO PELA PRATA • Etapas • 4º Revelação • Prata amoniacal – Formaldeído (agente redutor) e ácido cítrico ( íons Ag livre) • 5º Lavagens • Processo semelhante a revelação fotográfica.

35. REVELAÇÃO PELA PRATA • Prata amoniacal • + contraste • + sensibilidade • + demorada • Bandas ou spots • Marrom ou preta • Lipoproteínas • Azul • Glicoproteínas • Vermelho

36. REVELAÇÃO PELA PRATA • Vantagens • Sensibilidade • 100 x maior que o Coomassie • Abordagem proteômica • Pureza de uma ptn. • Detectar pequena quantidade de ptn. (Switzer et al., 1979) (Haines et al., 1990)

37. REVELAÇÃO PELA PRATA • Limitações • Necessita de muitas etapas •  Reprodutibilidade (~20% na intensidade de spots) • Alguns íons de prata pode interferir na identificação da ptn; • Não apresentar ponto de saturação. (Quadroni e James, 1999) (Oses-Prieto et al., 2007)

38. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA

39. DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA

40. MÉTODOS DE DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Detecção das imagens • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador; • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos;

41. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Detecção das imagens • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador; • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos. ;

42. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Detecção das imagens • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador; • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos; • Criação banco de dados.

43. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Detecção das imagens • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador; • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos; • Criação banco de dados.

44. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Eletroferograma • Câmeras acoplada a um computador; • Densicitometro; • Scanners.

45. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Scanner de Mesa • Alta performance; • Fácil uso – rápido; • Boa resolução; • Baixo custo.

46. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Imagem Scanner III • Alta resolução; • Densidade Ótica ( 3.4); • Resolução 100 e 600 dpi • Géis - 150 e 300 dpi • Revelações • Coomassie Blue • Prata

47. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Scanner de Mesa

48. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Scanner de tela de fósforo de armazenamento • Técnica de autoradiografia • > sensibilidade; • Rapidez; •  limite linear dinâmico; • Laser de HeNe • 633 nm

49. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Scanner fluorescentes

50. MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA • Scanner de Múltiplo propósito • Detecção fluorescente; • Tela de fósforo de armazenamento; • Quimiluminescência; • ≠ comprimentos de ondas associados a ≠ filtros; • Detectores são mais sensíveis