维生素 D 表观油水分配系数测定

1. 维生素D表观油水分配系数测定 1、目的要求 2、实验原理 3、试剂与器材 4、实验步骤 5、注意事项 6、思考题 吉林大学生物基础实验教学中心

2. 目的要求 • 掌握维生素D含量测定方法及原理。 • 掌握表观有水分配系数测定的方法及原理。

3. 实验原理 • 维生素D在285nm波长处吸光度(A)对浓度(C)在40-200μg·ml-1间呈良好的线性关系。 • 油水分配系数是指当药物在水相和油相 (非水相)达平衡时，药物在非水相中的浓度和在水相中的浓度之比。药物在体内的溶解、吸收、分布、转运与药物的水溶性和脂溶性有关，即和油水分配系数有关。体外测定油水分配系数，是为了模拟生物体内药物在水相和生物相之间的分配情况。许多有机溶剂曾被用来模拟生物相，如氯仿、正辛醇等，鉴于正辛醇的结构和理化性质的特点，更近似生物相，目前认为，正辛醇-水是一种良好的模拟系统， 被广泛采用。

4. 实验原理 • 分配系数的公式： P=C辛醇/C水 • 本实验计算维生素D在pH=7.4条件下的正辛醇－水分配系数。 • 药物的油水分配系数P 可用于预测其在肠道中的吸收情况。一般认为log P = 2～3 的药物在肠道中较易被吸收，而当药物的log P < 0 时则极不易被肠道吸收。

5. 试剂与器材 试剂：维生素D标准品、正辛醇、磷酸二氢钾 器材：紫外分光光度计、三角瓶（带塞）、烧杯500 ml/250ml、天平、量筒50ml/200ml、10mlEP管或试管、移液器200ul/1000ul、恒温水浴振荡器、滤纸涡流混悬仪、低速离心机

6. 实验步骤 1.水饱和的正辛醇与正辛醇饱和的磷酸缓冲液 配制pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液200ml。正辛醇200ml与磷酸缓冲液200ml在500ml烧杯中混合，静置24h后，上层即为正辛醇饱和的磷酸缓冲液，下层即为水饱和的正辛醇。分别取上层和下层于不同容器中。

7. 实验步骤 2.表观油水分配系数的测定 • 分别精密称取维生素D 5.0mg（准确记录称量值）三份于具塞三角瓶中，各加入水饱和的正辛醇30ml溶解，配制成3个维生素D正辛醇溶液。向维生素D正辛醇溶液中加入10ml的正辛醇饱和的磷酸盐缓冲液。放置在恒温水浴振荡器中，37℃时100 rpm振摇8~12h使分配达到平衡，低速离心（700rpm），得到上层正辛醇，待测。

8. 实验步骤 维生素D水饱和正辛醇溶液标准曲线的建立： • 配制浓度为40、80、120、160、200μg·ml-1的维生素D水饱和正辛醇溶液。 • 配制方法如下：

9. 称维生素D约5mg，用水饱和正辛醇溶液溶解成1mg/ml，作为母液。称维生素D约5mg，用水饱和正辛醇溶液溶解成1mg/ml，作为母液。 1mg·ml-1 200μg·ml-1 ⑤ 1mg·ml-1 160μg·ml-1 ④ 1mg·ml-1 120μg·ml-1 ③ 1mg·ml-1 80μg·ml-1 ② 1mg·ml-1 40μg·ml-1 ① 1ml 800μl 600μl 400μl 200μl 4ml水饱和正辛醇 4.2ml水饱和正辛醇 4.4ml水饱和正辛醇 4.6ml水饱和正辛醇 4.8ml水饱和正辛醇

10. 实验步骤 。 • 紫外测定波长285nm正辛醇相中的的吸收值，代入标准曲线计算相应的浓度，按照分配系数的公式 P=C辛醇/C水 • 计算维生素D在pH7.4值条件下的正辛醇－水分配系数，并记录入下表中。

11. 实验步骤 维生素D油水分配系数（P）的测定

12. 注释 磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制：取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，既得。

13. 思考题 • 为什么选择pH7.4的磷酸盐缓冲液？选择其他pH的磷酸缓冲液是否有意义？（如pH2） • 本实验得出的结果使你对维生素D的物理性质有什么认识？