软珊瑚 Sarcophyton tortuosum 内生真菌 SarcoF5 代谢产物研究

1. 软珊瑚Sarcophyton tortuosum内生真菌SarcoF5代谢产物研究 报告人：蔡永通 指导老师：李厚金副教授

2. 实验背景 一、软珊瑚Sarcophyton tortuosum 海底照片 水上照片 图1 扭曲肉芝软珊瑚的照片

3. 1986年本院天然室的苏镜娱等从软珊瑚Sarcophyton tortuosum中得到2个罕见的四环四萜化合物； • 2004年中山大学药学院蓝文健等又从该软珊瑚分离得到3个新的四萜化合物。

4. 发表的文章： • [1] J.Y.Su, T.S.Peng et a1. Studies on the Chinese Soft Coral,The Structure of Methyl sartortuoate. Acta Chem.sinica,1986,1,101. • [2] Jingyu Su, kanghou Long, Tangsheng Pang. The Structure of Methyl Isosartortuoate,a Novel Tetracyclic Tetraterpenoid from the Soft Coral Sarcophy tontortuosum. J.Am.Chem.Soc. 1986,108,177. • [3] Jingyu Su, Kanghou Long, Tangshen Peng et al.,Determination of Molecular and Crystal Stucture of a Unique New Tetraterpenoid-Methyl Sartotuoate.Science Sinica (SeriesB),1988,10 ,1172. • [4] Zeng Long-Mei, Lan Wen-Jian, Su Jing-Yu, Zhang Guang-Wen, Feng Xiao-Long, Liang Yong-Ju, Yang Xiao-Ping. Two new cytotoxic tetracyclic tetraterpenoids from the soft coral Sarcophyton tortuosum. Journal of Natural Products. 2004, 67(11), 1915-8. • [5] Lan W-J, Li H-J, Yan S-J, Su J-Y, Zeng L-M. New tetraterpenoid from the soft coral Sarcophyton tortuosum. Journal of Asian Natural Products Research. 2007, 9(3-5), 267-271.

5. 图2 四萜结构图(1)

6. 化合物活性 以上分离得到的四萜化合物对老鼠S180，CNE-2， P-388，HT-29，CNE-1显示了不同程度的抑制作用。

7. 因为这些四萜化合物具有显著的抗癌活性，因此在医药方面有很好的应用价值，但是因为其结构复杂，合成比较困难，因此对寻找其生源途径的研究变得非常重要。

8. 二、海洋共附生微生物 • 共附生或内生微生物（真菌、细菌、蓝菌等）是与海洋动植物处于共生、共栖、寄生或附生的关系的微生物。 • 从海洋附生微生物中分离得到许多具有生理活性的化合物。 • 海洋植物和无脊椎动物产生的活性物质实际上是由与其共附生的微生物产生的？

9. 分离得到的这些四萜化合物是来源于软珊瑚本身，还是由软珊瑚附生微生物产生而在珊瑚体内积累？分离得到的这些四萜化合物是来源于软珊瑚本身，还是由软珊瑚附生微生物产生而在珊瑚体内积累？ • 通过分离和纯化软珊瑚的共附生微生物，并且系统地研究附生微生物的代谢产物，将能揭示这些具抗肿瘤活性的四萜类化合物的真正来源。

10. 菌种的筛选 我们课题已经开展了该珊瑚附生微生物的分离工作，已经分离、纯化了30多株真菌和细菌，发现一株真菌（SarcoF5）在GYP培养基中生长良好。

11. (A) 培养10天的生长情况 (B) 培养20天的生长情况 (C) 培养30天的生长情况 (D) 培养40天的生长情况 图3 SarcoF5生长情况图

12. 微生物的培养 以葡萄糖(10g/L)、蛋白胨(3g/L)、酵母膏(1g/L)、100%人工海水(粗海盐23g/L)、pH7.5为培养基（GYP培养基）配制150L培养液分装到若干个1000ml的锥形瓶中，在124℃高温高压下灭菌1h。接入菌种扭曲肉芝软珊瑚内生真菌SarcoF5，28℃下静置培养40天。

13. 代谢产物的提取 待内生真菌SarcoF5长到40天后，用纱布过滤，培养液用乙酸乙酯提取三次，菌体用甲醇浸泡。合并乙酸乙酯提取液，旋转蒸发至干，浓缩得到棕色提取物43.16g，菌体的甲醇提取物也得到45.2g。

14. 培养液提取物的分离 图4 分离流程图

15. 实验结果 图5分离得到化合物结构图

16. 结构鉴定－SarcoF5-1 图6 SarcoF5-1结构图 实验分离出来的SarcoF5－1（青霉酸）是一种无色针状的晶体，分子式为C8H10O4,相对分子量为170.16。据文献报导它的熔点为83℃, 极易溶于热水、乙醇、乙醚和氯仿,但不溶于戊烷、己烷。

17. 图7 SarcoF5-1-1HNMR

18. 图8 SarcoF5-1-13CNMR

19. 图9 SarcoF5-1-DEPT-135

20. 表1 SarcoF5－1 NMR数据 (1H NMR 300MHz，13C NMR 75MHz，CDCl3，TMS)

21. SarcoF5-1互变反应 SarcoF5-1为青霉酸，是一个很强的多聚乙酰类霉菌毒素，首先由Alsberg等在1912年分离得到。 the lactone the keto acid Tautomerism of penicillic acid. Munday, C. W. Nature (London, United Kingdom) (1949), 163 443-4. CODEN: NATUAS ISSN: 0028-0836. Journal language unav-ailable. CAN 43:31631 AN 1949:31631 CAPLUS

22. 结构鉴定－SarcoF5-2 图10 SarcoF5-2结构图 SarcoF5-2为无色透明针状晶体，ESI-MS[m/z 213.2(M＋1)+]，分子式为C12H20O3。

23. 图11 SarcoF5-2-1HNMR

24. 图12 SarcoF5-2-13CNMR

25. 图13 SarcoF5-2-DEPT-135

26. 表2 SarcoF5－2 NMR数据 (1H NMR 300MHz，13C NMR 75MHz，CDCl3，TMS)

27. 结构鉴定－SarcoF5-3 图14 SarcoF5-3结构图 SarcoF5-3为无色透明树枝状晶体，EI-MS[m/z 228.2(M)+]，分子式为C12H20O4，不饱和度为3。

28. 图15 SarcoF5-3-1HNMR

29. 图16 SarcoF5-3-13CNMR

30. 图17 SarcoF5-3-DEPT-135

31. 表3 SarcoF5-3 NMR数据 (1H NMR 300MHz，13C NMR 75MHz，CDCl3，TMS)

32. 正在开展的研究 研究不同培养条件下的代谢产物情况： 1. 初步在GYP培养基中加入蒽酮，在培养液提取物中发现并分离得到了四萜化合物methyl sartort－uoate。在此培养条件下进行200L大规模的培养、提取工作已经完成。系统的分离工作正待开展。

33. 图18加入蒽酮后培养液提取物质谱图

34. 2. 利用甘油代替葡萄糖作为碳源，也培养了200升，提取、分离工作有待后续开展。 图19 大规模培养情况图

35. 致谢 本论文是在导师李厚金副教授的悉心指导下完成的，感谢李老师这一年来对我的培养和教诲。李老师严谨的科学作风和博学都是值得我一生学习的。 感谢张雷师兄、王守亮师兄和李淑清师姐等在实验过程中给予的帮助和支持。 本研究课题得到化学与化学工程学院第八届（2007年度）创新化学实验与研究基金项目的资助，在此深表感谢。

36. Thanks！