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第十三章 细 胞 凋 亡 检 测

第十三章 细 胞 凋 亡 检 测. 细胞凋亡的几种检测方法. 形态学观察： 普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜 磷脂酰丝氨酸外翻分析（ Annexin V 法） 线粒体膜势能的检测 DNA 片断化检测： 大分子染色体 DNA 片段、 DNA Ladder 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （ terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL ） 半胱氨酸蛋白酶 Caspase 家族活性的检测.

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第十三章 细 胞 凋 亡 检 测

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Presentation Transcript

  1. 第十三章 细 胞 凋 亡 检 测

  2. 细胞凋亡的几种检测方法 • 形态学观察：普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜 • 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） • 线粒体膜势能的检测 • DNA片断化检测：大分子染色体DNA片段、 DNA Ladder • 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL） • 半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的检测

  3. 细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体。细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体。

  4. 形态学观察 • 光学显微镜和倒置显微镜：体积缩小、核深染、核碎裂、 凋亡小体形成、无炎症反应 • 荧光显微镜和激光共聚焦显微镜： DNA特异性染料 （ Hoechest 33342/33258, DAPI） • 透射电子显微镜：超微结构是诊断凋亡的最可靠指标

  5. 电镜下：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。电镜下：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。

  6. Annexin V法 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）：细胞凋亡早期从内侧翻转到细胞膜表面 Annexin V:钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS可高亲和力特异性结合.由于PS外膜化比凋亡引起的核酸变化更早，所以该试剂盒比DNA检测法能更早期检测细胞凋亡

  7. Annexin V 与 PI联合 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，可检测早晚期的凋亡细胞。 已开发出多种荧光标记的试剂盒

  8. 荧光显微镜结果 流式细胞仪分析

  9. DNA 片 断 化 检 测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kb长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。

  10. (1) 本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(2) 不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。

  11. TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL) • 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大 量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化 物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的 3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测 • 是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单 个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应 细胞凋亡典型的生物化学和形态特征

  12. Caspase活性的检测 • 在正常状态下， Caspase家族都以无活性的酶原(30～ 50kD)形式表达，当细胞发生凋亡时Caspase可以被蛋白酶 裂解，大亚基和小亚基形成活化的Caspase 。一些Caspase 活化后可以次序激活其他Caspase形成Caspase级联反应， 促发细胞凋亡。在目前已知的14种Caspase中， Caspase- 3、Caspase-8和Caspase-9与凋亡的关系最为密切，在细 胞凋亡中起执行凋亡的作用。

  13. 相关基因表达的检测 • 细胞凋亡时许多基因表达异常，检测这些凋亡相关调 控基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的常用方法 • Fas ；c-myc；Bcl-2 和bcl-X 表达水平比例 • 方法：Northern杂交、PCR、Western Blot、免疫组化 • Amplifluor™ Apoptosis Gene Systems： 检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表 达水平

  14. 流式细胞仪对细胞凋亡的分析 • 线粒体功能 • Annexin V Assay • Caspases • DNA Fragmentation Assays • DNA Cycle • 优缺点：速度快、定量、收集大量数据 、 多参数测 量；分选；从细胞整体上测量，不能定位

  15. 凋亡检测方法的选择 • 每种检测方法均有其优缺点，应对其原理有所了解 • 根据自己的研究目的、样本种类选择合适的方法 • 一般选择两种以上不同检测方法 • 针对不同检测方法已开发出多种商业试剂盒，简化 了实验步骤和操作程序

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