 丙酮酸脱氢酶复合体

 丙酮酸脱氢酶复合体 丙酮酸脱氢酶复合体包括丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase)（E1），二氢硫辛酸乙酰转移酶(dihydrolipoic acid transacetylase)（E2）和二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoic acid dehydrogenase)（E3）三种不同的酶。 dihydrolipoyl transacetylase(E2) dihydrolipoyl dehydrogenase(E3)

丙酮酸脱氢酶的作用方式： 1．丙酮酸脱羧形成羟乙基-TPP 丙酮酸与丙酮酸脱羧酶(E1)上的TPP连接，TPP的噻唑环中氮和硫原子之间的碳原子的氢比大多数有=CH-基的氢更容易解离，使该碳原子形成反应性很强的负碳离子，因而可亲核攻击丙酮酸的羰基碳原子形成加成物。TPP的噻唑环上的N带有正电，可作为电子穴，使脱羧作用容易进行，脱羧后形成一个烯醇中间物，加氢后产生羟乙基TPP。

2．由二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2）催化使羟乙基被氧化成乙酰基，同时转移给硫辛酸与酶蛋白的赖氨酰ε氨基所形成的硫辛酰胺上，形成乙酰硫辛酰胺。2．由二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2）催化使羟乙基被氧化成乙酰基，同时转移给硫辛酸与酶蛋白的赖氨酰ε氨基所形成的硫辛酰胺上，形成乙酰硫辛酰胺。

3．二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2）还催化乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给CoA形成乙酰CoA。3．二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2）还催化乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给CoA形成乙酰CoA。

4．二氢硫辛酸脱氢酶（E3）使被还原的硫辛酰氨重新氧化，并将氢传递给它的辅基FAD。4．二氢硫辛酸脱氢酶（E3）使被还原的硫辛酰氨重新氧化，并将氢传递给它的辅基FAD。

5．FADH2再使NAD+还原，形成的NADH可进入呼吸链氧化并产生ATP。5．FADH2再使NAD+还原，形成的NADH可进入呼吸链氧化并产生ATP。 FADH2-E3 + NAD+ → FAD-E3 + NADH + H+

丙酮酸脱氢酶复合体作用模式 2 羧二氢硫辛酸乙酰转移酶 3 + 二氢硫辛酸脱氢酶 3 +

硫辛酰氨摇摆臂及其在丙 酮酸脱氢酶复合体中的作用

硫辛酰胺摇摆臂作用的主要步骤： A)硫辛酰胺与酶1结合的羟乙基TPP相互作用； B)在酶2上与辅酶A-SH作用产生乙酰辅酶A; C)与酶3的FAD作用产生二硫化合物。 8碳硫辛酸与酶2活性中心的6碳赖氨酸残基形成一个长度为14埃的柔性链。酶1上的TPP与酶3上的FAD相距约55埃；酶2上的单个硫辛酰胺臂的摆动不够连接酶1与酶3。这个问题的解决办法是酶2上至少有两个硫辛酰胺臂，每个长度为14埃的臂摆动时可覆盖28埃的距离，两个硫辛酰胺臂就可连接相距56埃的两个功能基团。第一条硫辛酰胺臂接受了酶1的二碳片段，然后以乙酰基形式转移到第二条臂，再直接转移到辅酶A上。带有两个巯基的还原的硫辛酰胺再由酶3氧化，酶3的FAD还原成FADH2。这些酶（E1,E2和E3)物理上的并列可以保证反应没有不需要的副反应，不使中间物从催化位点扩散，使反应能顺利进行。丙酮酸脱氢酶复合体是细胞通过催化连续反应的酶的并列来最经济的实现其功能的例子之一。

E.coli丙酮酸脱氢酶复合体电镜照片 大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶的分子量为4600000，是由60条多肽链组成的多面体，直径约30nm，在电镜下可观察到复合体的存在。二氢硫辛酸乙酰转移酶位于中心，有24条肽链。丙酮酸脱羧酶也有24条肽链，二氢硫辛酸脱氢酶由12条肽链组成。

 三羧酸循环的途径 三羧酸循环共有八步反应。

反应1：二个碳原子以乙酰辅酶A形式进入循环 乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。由柠檬酸合成酶催化的起始反应是一个类似于醛醇缩合的反应。 + CH3

柠檬酸合成酶反应机制 B是酶分子中的一个碱性氨基酸残基负碳离子 + 柠檬酰辅酶A 乙酰辅酶A上活化的乙酰基的甲基碳在柠檬酸合成酶的作用下丢失一个质子，所产生的负碳离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击。这导致缩合产生高度不稳定的柠檬酰辅酶A，可自发水解产生柠檬酸。这个反应是高度放能的，是整个反应的调节位点。

猪心柠檬酸合成酶三维结构 (a) “open” conformation (b) “close” conformation 哺乳类动物中柠檬酸合成酶由2个49000亚基组成。X-晶体衍射研究表明此酶催化反应时与底物结合会产生很大的构象变化。在没有底物时，这个酶的结晶是处于“打开”型，在二聚体蛋白两个催化域之间有大裂缝。与底物或CoA-SH的结合使酶处于“关闭”构象，裂缝基本上没有了。

柠檬酸合成酶反应机制的补充： 柠檬酸合成酶上有两个组氨酸残基起作用。其中一个与草酰乙酸羰基氧原子作用使其易受攻击，另一个组氨酸残基接受乙酰CoA的甲基碳上的质子。形成的柠檬酰CoA使酶结构进一步变化，使活性位置中增加一个天门冬氨酸残基，它可以捕获水分子以水解硫酯键。水解后CoA和柠檬酸相继离开酶，酶恢复成开放型。这样合成酶不会因水解乙酰CoA而造成浪费。因为只有酶与草酰乙酸结合后，才能与乙酰CoA结合，而且会引起硫酯键水解的天门冬氨酸残基，只有在形成柠檬酰CoA后才会接近活性中心。

柠檬酸合成酶是一个调控酶。酶活性在体外受ATP， NADH，琥珀酰CoA和长链脂肪酸的抑制。它催化的反应是可调控的限速步骤。氟乙酰CoA可与柠檬酸合成酶反应形成氟柠檬酸，因它可抑制酶的下一步反应，所以称这步反应为致死合成。

反应2．柠檬酸异构化生成异柠檬酸 柠檬酸由顺乌头酸酶催化脱水，然后再加水，从而改变分子内OH-和H+的位置，生成异柠檬酸。催化这两步反应的都是顺乌头酸酶。△G0’是 +6.3kJ/mol。由于异柠檬酸不断消失，推动反应进行。 HO

柠檬酸碳3上的羟基很难氧化。由顺乌头酸酶催化的异构化产生的异柠檬酸较容易氧化。柠檬酸碳3上的羟基很难氧化。由顺乌头酸酶催化的异构化产生的异柠檬酸较容易氧化。这个反应包括脱水和水化，顺乌头酸是脱水中间物。在250C,这三个酸的平衡混合物含有90%柠檬酸，4%顺乌头酸,6%异柠檬酸。顺乌头酸酶有铁-硫中心，包括非血红素铁和酸不稳定硫。铁通过与柠檬酸的羧基和羟基相互作用与柠檬酸形成复合物。顺乌头酸酶有立体专一性，只产生一种异柠檬酸。顺乌头酸酶是个相当复杂的酶，其中含有由4个铁原子，4个无机硫原子及4个半胱氨酸硫原子形成的铁硫中心参与底物的去水和加水反应。这个酶是含铁的非铁卟啉蛋白。

3．异柠檬酸氧化脱羧生成α酮戊二酸和第一个CO23．异柠檬酸氧化脱羧生成α酮戊二酸和第一个CO2 这是三羧酸循环中第一个氧化脱羧反应，反应由异柠檬酸脱氢酶催化。 + H

H 草酰琥珀酸反应的中间物是与酶结合的草酰琥珀酸，它是一个不稳定的β酮酸，在产物释放之前自发脱羧。

线粒体内含有两种异柠檬酸脱氢酶，一种是以NAD+为电子受体，另一种以NADP+为电子受体。前者仅存在于线粒体内，后者在细胞质和线粒体中都存在。异柠檬酸脱氢酶是三羧酸循环中第二个调节酶。线粒体内含有两种异柠檬酸脱氢酶，一种是以NAD+为电子受体，另一种以NADP+为电子受体。前者仅存在于线粒体内，后者在细胞质和线粒体中都存在。异柠檬酸脱氢酶是三羧酸循环中第二个调节酶。需NAD+异柠檬酸脱氢酶被Mg2+，Mn2+活化，它是一个别构酶，正调控物是ADP。ADP可增加酶和底物的亲和力。当缺乏ADP时就失去活性。NAD+, Mg++和ADP有协同作用。 NADH和ATP可以抑制酶活性。细胞在具有高能状态时即ATP/ADP, NADH/NAD+比值高时酶活性被抑制，在低能状态时被激活。

反应4. 由多酶复合物产生第二个CO2. α-酮戊二酸氧化脱羧成为琥珀酰CoA。这是三羧酸循环中第二个氧化脱羧反应，由α-酮戊二酸脱氢酶系催化。 + +

α酮戊二酸脱氢酶体系与丙酮酸脱氢酶体系相似，由三个酶即α酮戊二酸脱羧酶(E1)，二氢硫辛酰（酸）琥珀酰转移酶(E2)和二氢硫辛酰（酸）脱氢酶(E3)组成。也需要TPP，硫辛酸，CoA-SH，FAD和NAD+ 5种辅助因子。二氢硫辛酰（酸）琥珀酰转移酶处于核心位置，其氧化脱羧机制也类似。其E1和E2与丙酮酸脱氢酶中相应的脱羧酶及酰基转移酶的分子量不同，但二氢硫辛酸脱氢酶是相同的。

由α-酮戊二酸脱羧酶（E1)催化的第一个反应 这之后的4碳单位向硫辛酸的转移以及通过FAD和NAD+的氧化与丙酮酸脱氢酶的反应类似。

α酮戊二酸脱氢酶也是一个调节酶，受其产物NADH，琥珀酰CoA和Ca++的抑制。细胞高能荷时，ATP, GTP也可反馈抑制酶的活性，但是酶的活性不受磷酸化和脱磷酸化的共价修饰调节。

 丙酮酸脱氢酶 复合体