鼠類精原幹細胞的培養與鑑定 ( 未含血清的體外細胞培養模式 )

1. 鼠類精原幹細胞的培養與鑑定(未含血清的體外細胞培養模式)鼠類精原幹細胞的培養與鑑定(未含血清的體外細胞培養模式) 精原幹細胞為一群具有多功能潛力的幹原細胞，在適當調控下可以形成成熟的精子或是發展成為個胚層所需之細胞與組織。因此，為了研究早期精子生成作用相關的分子調控機制以及多功能性精原幹細胞發展的潛力，在體外建立不含血清的精原幹細胞培養系統使其可以長期培養及增生或是誘導其分化是所必需的，亦有助於進一步釐清精原幹細胞生長所需之生長因子及其作用機制。我們成功地利用ICR品系雄性小鼠睪丸中的細胞在體外培養出具有多功能特性的精原幹細胞群落，我們的實驗結果得知在laminin (6.25ng/ml)的coating material及EGF (10ng/ml) +倍Insulin/ transferring–selenium的培養下，這些細胞群落具有專一性且高度表現鹼性磷酸脢的活性及Oct4蛋白，顯現出這些細胞群落具有精原幹細胞的潛力。我們利用反轉錄聚合?連鎖反應以及細胞螢光免疫染色來鑑定精原幹細胞進一步專一性表現的基因及蛋白質，我們發現在mRNA層次上，細胞群落專一地表現精原幹細胞所特有的相關基因，包括Oct4, Mvh, Fragilis, Stella, Dazl, Tex14, Piwil2等但不表現c-kit及Gcnf (Oct4的抑制者)；在蛋白質層次上，則表現Oct4, SSEA1, CD29, CD49f等，但不表現CD117 (c-kit), CD30, CD34。此外，我們利用EGFP-lentivirus感染這些具精原幹細胞潛力的細胞群落來追蹤，再使用細胞移植後以檢驗細胞的功能性，結果顯示我們成功地將精原幹細胞移植至原本未能正常進行精子生成作用的睪丸中，並且有明顯的螢光表現。我們的實驗結果證實，於本實驗室之未含血清的體外細胞培養模式，可以成功地培養處於早期精原幹細胞(c-kit negative)的細胞群落。