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黄曲霉毒素的测定. 黄曲霉毒素（ Aflatoxins, 简写 AFT ），是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒株的代谢产物，是一群结构类似的化合物。目前已发现 17 种黄曲霉毒素，根据其在波长为 365nm 紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为 B 、 G 二大类，其中 B 大类在氧化铝薄层板上于紫外光下呈现蓝色荧光，而 G 大类则呈绿色荧光。. 黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中 AFT B1 的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格规定。 AFT 主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严重。.
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黄曲霉毒素的测定 • 黄曲霉毒素（Aflatoxins,简写AFT），是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒株的代谢产物，是一群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素，根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类，其中B大类在氧化铝薄层板上于紫外光下呈现蓝色荧光，而G大类则呈绿色荧光。
黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格规定。 • AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严重。
黄曲霉毒素允许量标准 • 食品品种 允许量标准（ppb或10-6） • 玉米、花生、花生油 ≤20 • 玉米及花生制品 ≤20 • 大米、其他食用油 ≤10 • 裱花蛋糕、饼干、面包≤5 • 婴儿代乳食品 不得检出
本章重点 薄层层析法测黄曲霉毒素 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年，它被列为AOAC(association of official agricultural chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。
原理 。 本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。 薄层色谱法黄曲霉毒素Bt的最低检出量为0．000 4ug，最低检出浓度为5ug／Kg。
仪器 小型粉碎机 样筛 电动振荡器 玻璃浓缩器 玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器 展开槽(25cm×6cm×4cm) 紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2)
试剂 • 三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。
吸附剂－－硅胶 薄层层析用硅胶有多种规格。 应用最多的是掺有粘合剂石膏的硅胶，称有硅胶G，其掺入的石膏量为5-20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来，对层析的结果产生一定影响。 硅胶H――不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。 硅胶HF254 ――掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。 硅胶GF254――含石膏及荧光物质。
黄曲霉毒素B1标准溶液 • 1、黄曲霉毒素B1标准贮备液：准确称取1～1．2mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此标准液浓度约为10ug／mL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确10．0ug／mL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800 .
2、黄曲霉毒素B标准使用液： I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。 Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。。 思考：在配制黄曲霉毒素B标准使用液时，为什么需要用贮备液来稀释而不是直接配制？
次氯酸钠溶液 • 配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g／L。 • 思考题： • 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？ • 消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。 • 2、为什么次氯酸钠溶液能起到消毒的作用？
操作步骤 • 样品处理→提取 →浓缩→薄板制备→点样→展开→定量
(1)样品处理 样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至0．5～lkg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。
(2)提取 称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液。 振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。
取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。
浓缩 将蒸发皿放在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确加入1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，再用此滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中。 注意：若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失。
测定－－单向展开法 • 1、薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊状后，倒人涂布器推成5cm×20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可再活化后使用。
点样 将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm，点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸边加。滴加样式如下： 第一点：10μL AFTB，标准使用液(0．04μg／mL)。 第二点：20μL样液。第三点：20μL样液+10μL 0.04μg／mL AFTBl标准使用液。第四点：20μL样液+10μL 0.02tLg，／m L AFTB。标准使用液。
展开与观察 • 在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下： a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0．000 4μg，可用作检查样液中AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四点AFTB1标准为0．002ug．主要起定位作用。 b．若第二点与AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中AFTBl含量<5ug／kg；若在相应位置上有蓝色荧光点，则须进行确证试验。
确证试验 为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。 第一点：10uL 0．04ug／mL AFTBl标准使用液。 第二点：20／μL样液于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40℃)，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：10uL 0.04ug／mL AFTBl标准使用液。第四点：20μL样液。
按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白对照。按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白对照。 ④稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1。标准点最低检出量(0.00 04μg)的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为即为5~g／kg． 若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计，减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：l0uL AFTB1，标准使用液(0.04ug／mL)。 第二点：根据情况滴加10uL样液。 第三点：根据情况滴加15uL样液。 第四点：根据情况滴加20uL样液。
4)结果计算 X = 式中：X 一 样品中AFTBl的含量，ug／kg； V1一加入苯一乙腈混合液的体积，mL； V2—出现最低荧光时滴加样液的体积，mL； D一样液的总稀释倍数； m1—加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g； 0.0004—AFTBl的最低检出限量，ug。
测定－－双向展开法 原理 如用单向展开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFTB1的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚做横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边，而AFTB1不动，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做纵向展开，样品在相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法的灵敏度。
操作步骤 (1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上，在距左边缘0．8～1cm第二篇食品理化检测技术处，各滴加10uL AFTB1(0.04ug／mL)标准液，在距左边缘2.8～3cm处，各滴加20uL样液。然后在第二块板的样液点上滴加l0uL AFTBl(0.04ug／mL)标准液，在第三块板的样液点上滴加10uL AFTB1(0.02ug／mL)标准液。
(2)展开： a．横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l～2次。 b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至10～12cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。
观察与评定结果 a．在紫外光下观察第一、二块板，若第二块板在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板与第二板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTBl含量<5ug／kg. b．若第一块板与第二块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，这第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按顺序做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性，则第二块板可省略，直接做第三块。
确认试验 另取薄层板二块，于第四、五两板距左边缘0.8～1cm处，各滴加10u LATTB1(0.04ug／mL)标准液及一小滴三氟乙酸；在距左边缘2.8～3cm处，于第四板滴加20uL样液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL样液、10uL。AFTBl(0.04ug／mL)标准液及一小滴三氟乙酸，反应5min后，用热风吹2min(板上温度不高于40℃)。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中(4)做确认试验.
(5)稀释定量： 若样液中AFTBl含量较高，可按单向展开法中(5)稀释定量操作。若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。 3.2.3 结果计算 同单向展开法。 3.2.4 说明及注意事项 用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25g／L)，浸泡消毒后再清洗之。
思考题 • 单向与双向展开法有什么不同？ • 各有什么优点？
