מיקרוסקופיה

1. 1590 - Hans & Zacharias Janssen מיקרוסקופיה 2012 – Super resolution microscope

2. רואים קרוב רואים גדול • המטרה: לראות גדול • גודל הדמות שנראה תלוי בגודל הדמות שתיווצר ברשתית. • ע"מ לקבל דמות גדולה על הרשתית צריך לקרב את העצם לעין. • מרחק הראיה הברורה המינימלי הוא ~25cm

3. הגדלה זוויתית

4. המבנה הבסיסי של מיקרוסקופ אור • ככל שהמוקד של העדשה קטן כושר ההגדלה של גדל. • בעיה: קשה ללטש עדשות עם מוקד מאוד קטן, וכמות האור שתעבור דרך עדשה זו תהיה מאוד קטנה. + בעיות דיפרקציה • פתרון: לשלב שתי עדשות. אחת שתיצור דמות מוגדלת של העצם וזכוכית מגדלת שתסתכל על הדמות המוגדלת.

5. המבנה הבסיסי של מיקרוסקופ אור • ההגדלה של המיקרוסקופ = הגדלה של העינית * הגדלה של העצמית • הגדלה של העינית : • הגדלה של העצמית: • הגדלה כוללת:

6. המבנה הבסיסי של מיקרוסקופ אור

7. המבנה הבסיסי של מיקרוסקופ אור

8. שבירת אור וחוק סנל Refraction of light at the interface between two media • מקדם השבירה: מקדם השבירה תלוי באורך הגל: • חוק סנל: • אורכי גל קצרים מתפזרים בצורה חזקה יותר (זווית שבירה גדולה יותר)

9. Chromatic Aberration

10. Chromatic Aberration

11. Spherical aberration • A perfect lens (top) focuses all incoming rays to a single point on the optic axis. • A real lens with spherical surfaces (bottom) focuses different rays to different points along the optical axis, depending on the radial position of each incoming ray.

12. Spherical aberration Apoint sourceas imaged by a system with negative (top), zero (centre), and positive (bottom) spherical aberration. Images to the left are defocused toward the inside, images on the right toward the outside.

13. הגדלה לעומת רזולוציה (כושר הפרדה) • הגדלה: היחס בין ממדי הדמות לממדי העצם. • רזולוציה: המרחק הקטן ביותר בין שתי נקודות בעצם, שעדיין מובחנים זה מזה ע"י הצופה/המצלמה. • הגדלה מעבר לכושר ההפרדה, נקראת הגדלה ריקה (empty magnification)

14. נפיצה - Light Diffraction Airy disk 1828

15. PSF (Point Spread Function) • בשל העקיפה, מקור אור נקודתי לא יצור דמות של נקודה.

16. PSF (Point Spread Function)

17. PSF (Point Spread Function) 2D PSF for different defocus The image of a point object Z=+2µm 3D PSF Measured Calculated z Z=0 Z=-2µm y x x

18. PSF (Point Spread Function) • הגדרה מלאה: ה-PSF מתאר את תגובת המערכת האופטית לקלט נקודתי. • המשמעות: פיקסל בודד בדמות האידיאלית ייוצג ע"י יותר מפיקסל בודד בדמות האמיתית .

19. Numerical Aperture The numerical aperture with respect to a point P depends on the half-angle θ of the maximum cone of light that can enter or exit the lens

20. Numerical Aperture NA=n sinm

21. Numerical Aperture

22. NA קובע את ה-PSF • NA הוא הפרמטר החשוב ביותר בקביעת הרזולוציה של המערכת

23. גבול הרזולוציה = גבול הדיפרקציה

24. קריטריון ריילי • The diffraction limit is defined based on the Rayleigh criteria קריטריון ריילי: גבול הדיפרקציה הוא כאשר המינימה הראשונה של דמות של מקור אור אחד חופפת למקסימום של הדמות של מקור האור השני. Resolutionx,y or d0 = 0.61λ / NA  d0: המרחק בין שני הפיקים.

25. הגדרות נוספות לגבול הרזולוציה

26. טווח הגדלה שימושי - Useful Magnification Range Useful Magnification (total) = 500 to 1000 × NA (Objective) Range of Useful Magnification (500-1000 x NA of Objective) הגדלה מתחת לטווח ההגדלה השימושי לא תאפשר רזולוציה טובה, הגדלה מעבר לטווח ההגדלה השימושי תהיה הגדלה ריקה.

27. מרחק עבודה – Working distance מרחק העבודה קטן ככל שההגדלה ו/או NA גדלים.

28. העצמית - Objective • מרבית העדשות עם NA גבוה (0.7 ומעלה) בנויות לעבודה עם זכוכית מכסה (cover glass) בעובי 0.17 mm (1.5). שימוש בזכוכית מכסה בעובי אחר יגרור פגיעה משמעותית ברזולוציה

29. העצמית - Objective

30. שיטות להגברת ניגודיות בכל השיטות מדובר באור עובר (transmitted light), כלומר מקור האור נמצא בצד אחד של הדוגמא והגלאי בצידה האחר.

31. Bright field • השיטה הפשוטה ביותר בטכניקות מיקרוסקופית אור. • אור לבן עובר דרך הדוגמא, אזורים בהם הדוגמא בולעת יותר אור ייראו כהים ואילו אזורים שקופים יותר (בליעה נמוכה) ייראו בהירים. מגבלות: • הדוגמא צריכה להיות דקה ע"מ שהאור יוכל לעבור דרכה. • דוגמאות שקופות (בעיקר בביולוגיה) ייצרו ניגודיות נמוכה. • במקרים רבים יש לצבוע את הדוגמא (+ קיבוע) ע"מ להבחין בפרטים.

32. Dark field • הבעיה: ב-Bright field הרקע בהיר והפרטים כהים. כל נקודה ברקע היא בעצם מקור אור נקודתי שיוצר בדמות PSF. אם הפרטים בדוגמא קטנים מגבול הרזולוציה הם יבלעו ברקע.

33. Dark field יתרונות: • סט-אפ פשוט. • מאפשר לראות דוגמאות ביולוגיות ללא צביעה. • אין ארטיפקטים. חסרונות: • מעט אור מגיע לגלאי ולכן צריך הארה מאוד חזקה של הדוגמא.

34. Phase contrast • הבעיה: ב-BF וב- DF לא ניתן להבחין בתאים דקים, שקופים, ללא צביעה. בשתי השיטות לא ניתן ליצור מספיק ניגודיות.

35. Phase contrast טכניקה זו מתרגמת שינויים בפאזה לשינויים בעוצמה

36. Phase contrast יתרונות: • פתרון טוב לצפייה בתאים חיים מאוד מסויימים. מגבלות: • מחייב עדשות מיוחדות. • מוגבל לתאים בעובי מסוים (5-10 מיקרון) ולא אחידים בעוביים. • לא מתאים לתאי צמח או רקמות. • ארטיפקטים (הילות בפרפריה של התאים).

37. Differential interference contrast (DIC) • נקראת גם נומרסקי או NIC. • שימושית לתאים שקופים לא צבועים. עובדת גם עם תאים עבים יותר מאשר בטכניקת ה-Phase contrast.

38. Differential interference contrast (DIC) • טכניקה זו מתרגמת את גרדיאנט אורך המסלול האופטי (הן במסלול הגאומטרי והן בפאזה) לשינויים בעוצמת הסיגנל. • בטכניקה זו נוצרות שתי דמויות BF של הדוגמא עם הסחה קטנה בין השתיים. איחוד של שתי הדמויות האלה גורמת להתאבכות בונה (אור בהיר) או הורסת (כהה) בדמות הסופית.

39. Differential interference contrast (DIC) יתרונות: • מתאים לעבודה עם טווח גדול יותר של תאים מאשר Phase contrast. • אין את ההילות המופיעות ב-Phase contrast. • ניתן להתמקד על חתך דק בתוך דוגמא עבה יותר. מגבלות: • אי אפשר להשתמש בפלסטיק. • בדוגמאות מאוד דקות הניגודיות תהיה נמוכה.

40. הבדלים בין DIC ל-Phase contrast

41. שיטות להגברת ניגודיות Bright-field DIC Phase-contrast Dark-field

42. שיטות להגברת ניגודיות BF DF Phase contrast