elektroforez n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
ELEKTROFOREZ PowerPoint Presentation
Download Presentation
ELEKTROFOREZ

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 37

ELEKTROFOREZ - PowerPoint PPT Presentation


  • 829 Views
  • Uploaded on

ELEKTROFOREZ. Elektroforez: Yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin kitlelerine oranıyla belirlenen hızlarda elektriksel alanda hareket (göç) etmeleri prensibine dayanır.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'ELEKTROFOREZ' - bergen


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide2

Elektroforez:

Yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin

izlendiği bir tekniktir.

Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin

kitlelerine oranıyla belirlenen hızlarda elektriksel alanda

hareket (göç) etmeleri prensibine dayanır.

Bu sistemde analizi yapılacak örnek bir destek ortamına

uygulanır. Bu destek ortam olarak daha çok jeller tercih

edilir.

slide3
Katı jel desteği ile ayırımı yapılacak moleküllerin hareketi,

moleküllerin yüküne, boyutuna, biçimine kimyasal içeriğine

ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır.

Elektroforezin bir homojenattaki farklı molekülleri ayırma

kapasitesi genellikle fazla değildir.

slide4
Elektroforez Yöntemleri:

Aralarındaki başlıca fark destek ortamının tipi ve

konumudur.

Dikey yada yatay konumdaki destek ortamı sellüloz yada

ince (poliakrilamid veya agaroz) jellerden hazırlanmış

olabilir.

slide5
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE):

Akrilamidin polimerizasyonu ile hazırlanan poliakrilamid

jellerin elektroforetik ayırımlarda çeşitli üstünlükleri vardır.

Küçük yada orta boydaki (1x106 Da’ya kadar) nukleik asitler

ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir.

slide6
Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez örnekteki

bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar çünkü ayrışım

hem moleküler elekleme hem de elektroforetik harekete

dayanır.

slide7
Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N’-

metilen-bis-akrilamidin serbest radikal polimerizasyonu ile

hazırlanır.

Kimyasal polimerizasyon bir başlatıcı-katalizör sistemi

(amonyum persülfat-TEMED) tarafından kontrol edilir.

slide8
Fotokimyasal polimerizasyon UV ışık altında riboflavin

tarafından başlatılır.

Proteinlerin ayrılması için kullanılan standart bir jel genelde

% 7.5 poliakrilamid içerir.

slide9
Poliakrilamid jel elektroforezi çubuk (tüp) biçiminde veya

düzlemsel (slab) biçiminde hazırlanmış jellerde

gerçekleştirilir.

Çubuk tipinde cam tüpler jel materyaliyle doldurulur;

polimerizasyon 30-40 dakikada tamamlanır.

Jel tüpü iki ayrı tampon deposu arasına yerleştirilir.

slide10
Üstteki depoda genellikle katod, alttakinde anod bulunur.

Biyolojik moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için anoda

doğru hareket edeceklerinden jel elektroforezi genellikle

bazik pH’da gerçekleştirilir.

slide12
Analiz edilecek örnek bir izleme boyası ile birlikte jelin

tepesine uygulanır ve sistemden elektrik akımı geçirilir.

Örnekteki bileşenlerden daha hızlı hareket eden izleme

boyası jelin bitimine ulaştığında akım kesilir, jel tüpten

çıkarılır ve boyanır.

Tabaka jeller aynı anda çok sayıda örneğin aynı destek

ortamında analiz edilmesine olanak vermeleri nedeniyle,

kolonlara göre daha geniş çapta kullanılmaktadır.

Polarizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik

bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar.

slide13
Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır, kuyucuklar tuzların

ve polimerize olmamış akrilamidin uzaklaştırılması amacıyla

tamponla yıkanır.

Jel kaseti iki tampon deposu arasına yerleştirilir,

kuyucuklara örnekler konur ve akım geçirilir.

Poliakrilamid jel elektroforezi uygulamalarında bazı

zorluklar vardır. Jellerin hazırlanmasında kullanılan

akrilamid monomeri bir nörotoksindir ve kanser oluşturma

tehlikesi olan bir maddedir, bu nedenle eldiven ile

çalışılmalıdır.

slide14
Agaroz Jel Elektroforezi

PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA parçalarının

ayırımı ve analizi için kullanışlıdır.

Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA

molekülü parçalarının ayırımı için uygun değildir.

200-50.000 bç boyutları arasındaki DNA ve RNA

moleküllerini tanımlamakta kullanılan standart yöntem

destek ortam olarak agarozun kullanıldığı elektroforezdir.

slide15
Agaroz çözeltisi 50oC’a kadar soğutulduktan sonra jel

kasetleri arasına veya jel tepsilerine dökülür.

%0.5’den daha düşük agaroz içeren jeller çok kırılgan

olduğundan yatay sistem tercih edilir.

Nukleik asitlerin agaroz jeldeki hareketleri agaroz

konsantrasyonu ile nukleik asit moleküllerinin boyutları ve

şeklinden etkilenir.

Nukleik asitlerin ayırımı için en etkin agaroz

konsantrasyonları % 0.3-2.0’dir.

slide18
Agaroz jel elektroforeziyle özellikle değişik kökenli

(kromozom, plazmid, organellere ait) DNA’ların izole

edildikleri ve/veya restriksiyon enzimleriyle kesildikleri

durumda molekül ağırlıkları ve miktarları belirlenebilir.

Bu teknik, RNA’ya ait küçük (<500 nukleotid) parçaların

ayrılması için kullanışlı bir sistem sağlar.

Daha büyük (>500 nukleotid) tek zincirli parçaların ayrılması

ve denatüre agaroz jellerin kullanımıyla yapılabilmektedir.

Agaroz jel elektroforezi proteinlerin yüklerine göre

ayrılmasında da kullanılmaktadır.

slide19
Değişken Alanlı (Pulsed Field) Jel Elektroforezi

Değişken Alanlı Jel Elektroforezi (PEGE) ile büyük DNA

molekülleri (maya kromozomlarının 200-300 kb boyutundaki

DNA’ları) ayrılabilmektedir.

PEGE’nin en belirgin farklı, uygulanan elektrik alanının sabit

olmaması, ayırma sırasında yönün ve şiddetinin tekrarlanan

biçimde değiştirilmesidir.

slide20
İzoelektrik Odaklama:

Proteinlerin elektroforetik analizi için geliştirilmiş etkin bir

teknik İzoelektrik Odaklama (isoelectric focusing, IEF) dir.

Bir proteinin net yükü pH’ya bağımlıdır. Proteinler

izoelektrik pH’larının (net yükün sıfır olduğu pH, pHI)

altında pozitif olarak yüklüdürler ve sabit pH’lı bir ortamda

negatif yüklü elektroda (katod) doğru göç ederler.

İzoelektrik noktalarının üstündeki pH’da ise, protein proton

kaybeder, negatif yüklü hale geçer ve pozitif yüklü (anod)

doğru göç eder.

slide21
Elektroforez ortamının pH’sı proteinin pHI’sına eşitse,

proteinin net yükü sıfır olacağından elektrodların hiçbirine

doğru hareket etmez.

Anoda bir asit (genellikle fosforik asit ), katoda da bir baz

(trietanolamin) yerleştirilir.

slide23
Bir karışımdaki farklı protein molekülleri farklı pHI

değerlerine sahip olacağından bunların IEF uygulamasıyla

ayrılmaları mümkün olur.

İki Boyutlu Elektroforez:

SDS-PAGE ile proteinlerin ayrımının molekül boyutuna göre

yapılmasına karşılık, IEF ile ayırım yüke dayanır.

Bu iki yöntemin bileşimi olan iki boyutlu (2D) elektroforez,

kompleks protein karışımlarının ayrışımında önemli

ilerlemelere yol açmıştır.

slide24
İki farklı şekilde uygulanabilir;

Ya önce IEF, daha sonra SDS-PAGE yapılır ya da “ISODALT”

adı verilen sistem yardımıyla her ikiside aynı

zamanda gerçekleştirilir.

En yaygın olarak kullanılan O’Farrell sisteminde birinci

boyutta iyonik olmayan deterjanlar ve üre varlığında,

denatüre koşullarda çubuk jelde IEF gerçekleştirilir.

slide25
İkinci boyutta ise çubuk jel SDS-PAGE jeli üzerine

uygulanır.

Ayırım sonunda jel boyandığında tek bir jelde en az 1000

farklı proteinin görüntüsü elde edilebilmektedir.

slide28
Kılcal (Kapiler) Elektroforez:

Yüksek ayrıştırma gücü ile HPLC’nin hız, çok yönlülük ve

otomasyon özelliklerini birleştiren yeni bir tekniktir.

Çok az miktardaki örneğin (5-10 μl), yüksek

çözünürlükte ayrışımını ve attomol (10-18 mol) düzeyinde

duyarlılıkla analizini sağlar.

slide29
Amino asitlerin, proteinlerin, nukleik asitlerin analizinde

geniş çapta kullanılan bir tekniktir.

Bir güç kaynağı, iki tampon deposu, tamponla doldurulmuş

kılcal ir tüp (kolon) ve sürekli çalışan bir algılayıcıdan

ibarettir.

slide30
Kılcal tüpler 50-100 μm çapında ce 25-100 cm boyunda

esnek silikadan yapılmıştır.

Güç kaynağına bağlanmış olan platin elektrodlar tampon

depolarına daldırılır.

Kılcal tüpe yüksek voltaj uygulanır ve az miktarda örnek

solüsyon kılcal tüpün bir ucuna injeksiyon ile uygulanır.

slide31
Solüsyon içindeki moleküller elektrik alanının etkisi altında

kılcal tüp boyunca hareket ederler.

Tüpün diğer ucundan dışarı çıkan moleküller saptanır.

Saptamada, ayrılan moleküllerin tipine göre değişir ama

genel olarak UV-VIS dalga boylarında çalışan algılıyıcılardan

yararlanılır.

slide33
En önemli üstünlüğü, HPLC gibi bir çok analitik deney

tasarımına uygun olmasıdır.

Immünoelektroforez:

IE kompleks proteinlerin analizinde uygulanan ardışık iki

işlem vardır.

slide34
1) Karışımdaki proteinlerin agaroz jel elektroforeziyle

ayrılması

2) Ayrılan proteinlerin antijenik özelliklerini belirlemek

üzere özel antikorlarla etkileşime sokulmaları

slide36
KULLANIM ALANLARI

• Saflaştırma

• Saflık kontrolu

• Molekül ağırlığı saptama

• Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalık saptama

• Enzim izozimlerinin saptanması (tanısal amaçlı, populasyon çalışması için,

adli tıpta)

• İmmünolojik ve moleküler biyoloji