第 4 章 单分子分析

1. 第4章 单分子分析

2. 单分子检测原理 在凝聚态,一个分子的荧光辐射通常按以下四个步骤循环 发生: ①.电子基态向电子激发态的跃迁,其速率与激发光功率 成线性关系; ②.电子激发态的内弛豫; ③.由电子激发态向电子基态的辐射或非辐射跃迁,其速 率与激发态寿命有关; ④.电子基态的内弛豫.

3. 单分子检测原理 对于凝聚相中的小分子,振动和转动弛豫发生在皮秒 量级上,而吸收时间和激发态寿命发生在亚纳秒至纳秒量 级.因而,吸收周期主要由吸收和发射步骤决定. 当一个分子退激回到基态时,分子处于新一轮激发和发 射的状态.这种一个分子反复激发而发射出大量光子的现 象被称为光子爆发. 在理想情况下,一个分子大约能辐射出105-106个荧光光 子.如罗丹明6G在乙醇溶液中可辐射1.7×106个光子.

4. 对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求: ①.在被照射的体积中只有一个分子与激光发生 相互作用; ②.确保单分子的信号大于背景干扰信号.

5. 如何实现??? • 通过降低体系的浓度(密度)和缩小探测体积可达 • 到这两点要求. • 这里给出一个简单的计算例子:假设探测体积为1fL(10-15L),分析浓度为0.1nmol/L,则探测区内所含分析物的量为10-25mol,即平均含0.06个分子. • 这意味着大部分时刻没有分子在探测区,偶尔一个分子扩散进入探测区.

6. 单分子荧光的判断标准: ①.检测到的荧光信号出现的频率或数目必须与分析物 的浓度成线性关系,而信号的强度不变; ②.光漂白要么完全发生,要么完全不发生,不存在中间 模式; ③.由于分子所处环境的扰动,不同分子的光谱,不同时 间的光谱是变化的; ④.信号依赖于激发强度,对单个分子而言会出现饱和; ⑤.检测到的荧光数目不能超过单个分子在一个荧光周 期内所能发射的光子数. ⑥.由于分子之间是彼此分离的,荧光信号与时间的关系 应该呈现出反群聚性.

7. 单个ＤＮＡ分子的荧光光漂白 A.单个-DNA/Ru(phen)2dppx2+的荧光 B.单个-DNA/Ru(phen)2dppx2+的荧光的光漂白

8. 单个ＤＮＡ分子的荧光光漂白的抑制 A.单个-DNA/Ru(phen)2dppx2+的荧光光漂白; B.A+巯基乙醇; C.A+巯基十一酸

9. 单分子荧光特征 单分子荧光的典型特征是量子跳跃现象,既会形成一 个发射-暗态交替的量子跃迁过程,这一重要特征导致了实 验中观察到的单分子荧光光谱和荧光强度的波动现象. 单分子的荧光强度随时间的变化

10. 单分子荧光特征 单分子荧光的另一重要特征是其偏振特性.单个荧 光分子具有其唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩,分子 只吸收那些偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的 光子,并发出具有一定偏振方向的荧光.

11. 单分子检测方法 1.光子爆发检测 2.单分子图象记录 3.单分子光谱测绘 4.荧光相关光谱

12. 光子爆发检测 光子爆发检 测最为简单, 直接测定爆 发的光子数. 图 单分子的光子爆发检测 a.样品 b.空白

13. 单分子成像 单分子成像可指示分子在图像中的位置和发光强弱,实时 跟踪记录单分子. (1) (2) 图 单分子荧光成像图(1)和荧光光谱(2) 荧光成像图上的亮点对应一个个分子:光谱A和光谱B分别 来自不同空间位置上的分子A和B.

14. 单分子光谱测绘 单分子荧光光谱 的形状和强度随时间 而波动,这种波动源自 单分子荧光的典型特 征-量子跳跃现象.这些 固有的涨落包含着有 关单分子和其周围环 境之间丰富的动态信 息. 单分子光谱随时间的波动

15. 荧光相关光谱-先进共聚焦荧光显微镜E.coli bacterium(approx.0.2fL).

16. 荧光相关光谱 荧光强度可以用自相关方程(G(t))来分析: G(0): the autocorrelation function at time 0 1 : the chacteristic diffusion time of the particle though the sample volume P: is the structure parameter, which is the ratio between the transversal and longitudinal radius of the sample volume p=1/ 2

17. 荧光相关光谱 - 自相关曲线(auto-correlation curve)

18. 荧光相关光谱-浓度测量(Eigen, PNAS, 1994, 5740;Schwille, Biophys.J. 1997,1878) • TheVeff can beeasily obtained from calibration experiment, and G(0) can be read out from the auto-correlation curve.

19. 单分子检测的应用 ①.超灵敏分析和仪器微型化 ②.活细胞分析 ③.DNA测序 ④.分子马达 ⑤.单分子动力学

20. 单分子力-原子力显微镜

21. 原子力显微镜的构成: ①.带针尖的微悬臂 ②.微悬臂运动检测装置(微悬臂运动可用隧道电流检测等电学方法或光束偏转法、干涉法等光学方法检测.) ③.监控其运动的反馈回路 ④.使样品进行扫描的压电 陶瓷扫描器件 ⑤.计算机控制的图像采集 ⑥.显示及处理系统组成。

22. 原子力显微镜成像原理-虎克定律 在AFM中，使用对微弱力非常敏感的弹性悬臂上的 针尖对样品表面作光栅式扫描。 当针尖和样品表面的距离非常接近时，针尖尖端的原子与样品 表面的原子之间存在极微弱的作用力（10-12~10-6N），此时，微悬臂就会发生微小的弹性形变。 针尖与样品之间的力F与微悬臂的形变 之间遵循虎克定律： F=-k*x ，其中，k为微悬臂的力常数。 测出微悬臂形变量，就可以获得针尖与样品之间作用力的大小。

23. “恒力”模式 针尖与样品之间的作用力与距离有强烈的依赖关系，所以在扫描过程中利用反馈回路保持针尖与样品之间的作用力恒定，即保持为悬臂的形变量不变，针尖就会随样品表面的起伏上下移动，记录针尖上下运动的轨迹即可得到样品表面形貌的信息。这种工作模式被称为“恒力”模式（Constant Force Mode），是使用最广泛的扫描方式。

24. 原子力显微镜- “恒高”模式 AFM的图像也可以使用“恒高”模式（Constant Height Mode） 来获得，也就是在X，Y扫描过程中，不使用反馈回路，保持针 尖与样品之间的距离恒定，通过测量微悬臂Z方向的形变量来成 像。这种方式不使用反馈回路，可以采用更高的扫描速度，通 常在观察原子、分子像时用得比较多，而对于表面起伏比较大 的样品不适用。

25. 单分子力-原子力显微镜 AFM有多种操作模式，常用的有以下4种： 接触模式（Contact Mode）,非接触（Non-Contact Mode） 轻敲模式(Tapping Mode),侧向力(Lateral Force Mode)

26. 原子力显微镜-接触模式 在接触模式中，针尖始终与样品保持轻微接触，以恒高或恒力的模式进行扫描。扫描过程中，针尖在样品表面滑动。通常情况下，接触模式都可以产生稳定的、高分辨率的图像。 　　 在接触模式中，如果扫描软样品的时候，样品表 面由于和针尖直接接触，有可能造成样品的损伤。如 果为了保护样品，在扫描过程中将样品和针尖之间的 作用力减弱的话，图像可能会发生扭曲或得到伪像。 同时，表面的毛细作用也会降低分辨率。所以接触模 式一般不适用于研究生物大分子、低弹性模量样品以 及容易移动和变形的样品。

27. 原子力显微镜-非接触模式 在非接触模式中，针尖在样品表面上方振动， 始终不与样品接触，探针监测器检测的是范德华 力和静电力等对成像样品的无破坏的长程作用力。 这种模式虽然增加了显微镜的灵敏度，但当针尖与样品之间的距离较长时，分辨率要比接触模式和轻敲模式都低，而且成像不稳定，操作相对困难，通常不适用于在液体中成像，在生物中的应用也比较少。

28. 原子力显微镜-轻敲模式 轻敲模式:微悬臂在其共振频率附近作受迫振动，振荡的针尖轻轻的敲击样品表面，间断的和样品接触，所以又称为间歇接触模式。 　　 由于轻敲模式能够避免针尖粘附到样品上，以及在扫描过程中对样品几乎没有损坏。轻敲模式的针尖在接触表面时，可以通过提供针尖足够的振幅来克服针尖和样品间的粘附力。 同时，由于作用力是垂直的，表面材料受横向摩擦力、压缩力和剪切力的影响较小。轻敲模式同非接触模式相比较的另一优点是大而且线性的工作范围，使得垂直反馈系统高度稳定，可重复进行样品测量。　　

29. 原子力显微镜-轻敲模式 轻敲模式在大气和液体环境下都可以实现。在大气环境中，当针尖与样品不接触时，微悬臂以最大振幅自由振荡；当针尖与样品表面接触时，尽管压电陶瓷片以同样的能量激发微悬臂振荡，但是空间阻碍作用使得微悬臂的振幅减小，反馈系统控制微悬臂的振幅恒定，针尖就跟随样品表面的起伏上下移动获得形貌信息。 轻敲模式同样适合在液体中操作，而且由于液体的阻尼作用，针尖与样品的剪切力更小，对样品的损伤也更小，所以在液体中的轻敲模式成像可以对活性生物样品进行现场检测、对溶液反应进行现场跟踪等。

30. 原子力显微镜-侧向力模式 横向力显微镜（LFM）工作原理与接触模式的原子力显微镜相似。当微悬臂在样品上方扫描时，由于针尖与样品表面的相互作用，导致悬臂摆动，其形变的方向大致有两个： 垂直与水平方向 　　一般来说，激光位置探测器所探测到的垂直方向的变化，反 映的是样品表面的形态，而在水平方向上所探测到的信号的变化 ，由于物质表面材料特性的不同，其摩擦系数也不同，所以在扫 描的过程中，导致微悬臂左右扭曲的程度也不同。

31. 原子力显微镜-侧向力模式 微悬臂的扭转弯曲程度随表面摩擦特性变化而增减（增加摩擦力导致更大的扭转）。激光检测器可以实时分别测量并记录形貌和横向力数据。 通常不仅样品表面组分不同可以导致微悬臂扭曲，样品表面形貌的变化也会导致微悬臂的扭曲， 为了区分这二者，通常LFM图像和AFM图像应该同时获得。根据导致微悬臂扭曲的原因不同，通常可以利用LFM获得物质表面的组分构成像和“边缘增强像”。

32. 原子力显微镜

33. 原子力显微镜常用的样品基底 ①.云母 ②.金表面 ③.硅表面 ④石墨(HOPG)

34. 原子力显微镜针尖的扫描电镜图(SEM)

35. 原子力显微镜研究药物分子与DNA的相互作用 (PNAS,1996,12283-12286)

36. DNA吸附在石墨表面的原子力成像 (Langmuir,2003,)

37. DNA与蛋白质激酶的相互作用

38. 原子力显微镜研究DNA凝聚 (Biochemistry,1999,38,14069-14076)

39. 原子力显微镜成像获得ＤＮＡ转录的中间体 （PNAS,2001,98,8454-8460.)

40. -CD与二茂铁的相互作用的单分子力 (Langmuir,2002,18,6988-6994.)

41. 双螺旋DNA单分子的测定(PNAS,1999,96, 11277-11282)

42. 单碱基对之间的力(Nanoletters,2003,3,493-496)

43. 原子力显微镜研究三螺旋DNA的稳定性(J.Am.Chem.Soc.2004,126, 13992-13997) .

44. 原子力显微镜研究三螺旋DNA的稳定性(J.Am.Chem.Soc.2004,126, 13992-13997)

45. 原子力显微镜研究双螺旋DNA的稳定性

46. 力量子与针尖扫描速度的关系 (compare with that of dsDNA

47. 原子力显微镜研究三螺旋DNA与小分子的相互作用原子力显微镜研究三螺旋DNA与小分子的相互作用

48. Histogram of rupture force of triplex DNA in the presence of Ru(phen)32+ Applied physics Letters.2006,89,113902.

49. Rupture force between the third strand and double strand within triplex DNA in the presence of Ru(bipy)2(dppz)2+ Applied physics Letters.2006,89,113902.

50. Histogram of rupture force of triplex DNA in the presence of Ru(phen)2(dppz)2+ Applied physics Letters.2006,89,113902.